【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
,具体涉及一种快速恒温检测沙门氏菌的方法、引物及试剂盒。
技术介绍
沙门氏菌(Salmonellaspp.)是一类革兰氏染色阴性杆菌,主要栖息于人和动物的肠道中,由粪便排出体外,并通过被污染的水和食物进一步传播,能引起人胃肠炎、伤寒和副伤寒等症状。近年来,沙门氏菌在全球范围内引起的危害呈不断上升趋势,是公共卫生领域的重要致病菌。因此,对于该菌的检测和预防都具有重要意义。传统沙门氏菌检测方法由于检测周期较长,操作相对复杂,检测效率较低,难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。近年来随着核酸分子检测技术的发展,研究人员陆续开发出了PCR和荧光PCR技术的检测手段,但是这两种方法都需要专门的检测仪器,因此,并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为了确保食品安全,急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的沙门氏菌。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法,该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP,其中FIP由F1C和F2组成,BIP由B1C和B2组成),利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件保温约60min,即可完成核酸扩增反应,产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,AminoN,H ...
【技术保护点】
一种快速恒温检测沙门氏菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)从待测样品中提取基因组DNA;(2)以所述基因组DNA为模板,以能扩增沙门氏菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物,在酶反应体系下进行恒温扩增反应;(3)通过判断反应结果是否为阳性,确定待测样品中是否存在沙门氏菌;其中,所述沙门氏菌基因组特异性碱基序列为GI号为194447306的沙门氏菌基因组的4188946~4189180bp位序列。
【技术特征摘要】
1.一种快速恒温检测沙门氏菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)从待测样品中提取基因组DNA;(2)以所述基因组DNA为模板,以能扩增沙门氏菌基因组特异性碱基序列的引物组作为引物,在酶反应体系下进行恒温扩增反应;(3)通过判断反应结果是否为阳性,确定待测样品中是否存在沙门氏菌;其中,所述沙门氏菌基因组特异性碱基序列为GI号为194447306的沙门氏菌基因组的4188946~4189180bp位序列。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述能扩增沙门氏菌基因组特异性碱基序列的引物组序列为GI号为194447306的沙门氏菌基因组4188946~4189180bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述能扩增沙门氏菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物组A;或选自与所述引物组A序列或其互补链序列中单条序列同源性为73.7%及以上的引物组之任意一组;引物组A:上游外引物F3_A:5’-AGGCTTTAAAAAGGCCATG-3’(SEQIDNO:1);下游外引物B3_A:5’-TAACGAACACTAACAGCAG-3’(SEQIDNO:2);上游内引物FIP_A:5’-TTTTCGCTTCGCCTTGCTTAATGCCAAACAGGATAAAACC-3’(SEQIDNO:3);下游内引物BIP_A:5’-AGGAAGACGCTAAAAGCCAACGCTAAAACCGATATCAAAC-3’(SEQIDNO:4)。4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,与所述引物组A序列或其互补链序列中单条序列同源性为73.7%及以上的引物组包括以下引物组B:引物组B:上游外引物F3_B:5’-AAAAACTCGGTTCCATCG-3’(SEQIDNO:5);下游外引物B3_B:5’-AACACTAACAGCAGTTCG-3’(SEQIDNO:6);上游内引物FIP_B:5’-GACTGGTTTTATCCTGTTTGGCGCGTCTATCAAAGGCTTT-3’(SEQIDNO:7);下游内引物BIP_B:5’-GCTAAATCTATCGCGGATAAGCAACGGATTATACCTGCTCTT-3’(SEQIDNO:8)。5.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述能扩增沙门氏菌基因组特异性碱基序列的引物组还包含一条环引物;所述环引物为LF或LB。6.如权利要求5所述的方法,其特征在于,所述能扩增沙门氏菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下引物组A’,B’之任意一组;或与所述引物组A’,B’序列或其互补链序列中单条序列同源性为73.7%及以上的引物组之任意一组:引物组A’:上游外引物F3_A:5’-AGGCTTTAAAAAGGCCATG-3’;下游外引物B3_A:5’-TAACGAACACTAACAGCAG-3’;上游内引物FIP_A:5’-TTTTCGCTTCGCCTTGCTTAATGCCAAACAGGATAAAACC-3’;下游内引物BIP_A:5’-AGGAAGACGCTAAAAGCCAACGCTAAAACCGATATCAAAC-3’;上游环引物LF_A:5’-CGGTAAAATCAGCGTCCTGA-3’(SEQIDNO:9);引物组B’:上游外引物F3_B:5’-AAAAACTCGGTTCCATCG-3’;下游外引物B3_B:5’-AACACTAACAGCAGTTCG-3’;上游内引物FIP_B:5’-GACTGGTTTTATCCTGTTTGGCGCGTCTATCAAAGGCTTT-3’;下游内引物BIP_B:5’-GCTAAATCTATCGCGGATAAGCAACGGATTATACCTGCTCTT-3’;下游环引物LB_B:5’-GGCGAAGCGAAAAAGGAAGA-3’(SEQIDNO:10)。7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述酶反应体系包括:1×BstDNA聚合酶反应缓冲液,2-9mmol/LMg2+,1.0-1.6mmol/LdNTP,0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物,0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物,0.16-0.64U/μLBstDNA聚合酶,0-1.5mol/L的甜菜碱,包括或不包括0.4-1.0μmol/L的LF或LB引物。8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述恒温扩...
【专利技术属性】
技术研发人员:韦朝春,李雪玲,李园园,刘伟,贾犇,陆长德,李亦学,
申请(专利权)人:上海生物信息技术研究中心,
类型:发明
国别省市:上海;31
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