一种针对沙门氏菌的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种针对沙门氏菌的检测方法，该方法先将沙门氏菌与包被的单克隆抗体结合，接着连接生物素化的多克隆抗体，再连接链霉亲和素标记的触酶C100，通过触酶催化双氧水分解，降低对巯基丙酸修饰的碲化镉量子点的荧光淬灭，根据荧光强度的高低来判断样品中沙门氏菌的浓度。该方法基于双抗夹心酶联免疫技术，并采用了生物素‑亲合素系统用于反应的放大。更为重要的是，由于本发明专利技术采用了新的抗体标记酶(触酶C100)和更为灵敏的荧光底物(碲化镉量子点)，并匹配了有效的反应条件，使得检测灵敏性得到显著提升，同时降低成本、提升检测效率，因此具有良好的推广前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了，该方法先将沙门氏菌与包被的单克隆抗体结合，接着连接生物素化的多克隆抗体，再连接链霉亲和素标记的触酶C100，通过触酶催化双氧水分解，降低对巯基丙酸修饰的碲化镉量子点的荧光淬灭，根据荧光强度的高低来判断样品中沙门氏菌的浓度。该方法基于双抗夹心酶联免疫技术，并采用了生物素?亲合素系统用于反应的放大。更为重要的是，由于本专利技术采用了新的抗体标记酶(触酶C100)和更为灵敏的荧光底物(碲化镉量子点)，并匹配了有效的反应条件，使得检测灵敏性得到显著提升，同时降低成本、提升检测效率，因此具有良好的推广前景。【专利说明】
本专利技术涉及微生物检测
，进一步涉及基于ELISA的抗原检测技术，具体涉及。
技术介绍
沙门氏菌(SalmonelIa)为革兰氏阴性短杆菌，无荚膜和芽孢，大部分属于需氧，小部分兼性厌氧菌，有鞭毛;生长温度范围广，可在10-42°C条件下生长，最适温度为370C，最佳pH6.8-7.8;沙门氏菌分布广，是引起食物中毒的重要病原菌，很容易在动物与动物、动物与人、人与人之间通过直接或间接的途径传播，没无中间宿主，能引起人和动物伤寒、副伤寒和食物中毒，导致肠热症、败血症和胃肠炎三类疾病。近年来，由于环境污染的加剧及食品生产流通的全球化，食品在从原材料到生产、运输、销售的各个环节都极易受到细菌污染，造成细菌性食物中毒，每年由沙门氏菌引起的食物中毒病例多达几千万，造成很大的健康危害和经济损失。在各类细菌性的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒位居前列。在我国，沙门氏菌引起的食物中毒占首位，沙门氏菌食物中毒和动物感染沙门氏菌十分严重，已引起各界学者的广泛重视。现有技术中，检测沙门氏菌常用方法包括传统检测方法、以分子生物学为基础的检测方法以及免疫学为基础的检测方法三大类。常用传统检测方法需要预增菌，选择性增菌，分离培养以及生化鉴定四个步骤。其结果准确、可靠的，但需经过预增菌以及生化试验等一系列复杂繁琐的操作，检测周期一般需要4-7天才能完成。因此，传统的检测技术已无法满足对食品中沙门氏菌的快速检出。以分子生物学为基础的检测方法包括核酸探针技术，PCR技术以及基因芯片技术等技术;尽管该类方法具有灵敏度高等特点，但需依赖于昂贵的仪器设备和熟练的操作人员，且需复杂的样品前处理，因此无法满足基层及现场实地监控的需要。免疫学方法主要包括直接免疫荧光(IFA)法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫磁性分离(IMS)、乳胶凝集试验等，该类方法基于免疫学的快速筛查，具有通量高、检测快速、价格便宜等优势，近年来得到了大量的推广和应用。特别是，酶联免疫吸附法(ELISA)方法因具有快速、灵敏、特异、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器设备，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测等优点，已成为沙门氏菌快速筛查检测的主要方法。然而，现有技术中检测沙门氏菌的ELISA方法普遍基于辣根过氧化物酶标记的抗体或抗原催化双氧水生成羟自由基，进而氧化无色的化学显色底物四甲基联苯二胺(TMB)形成蓝色产物，然后使用终止液(2M H2SO4)终止反应形成黄色溶液于450nm处记录吸光度值。该类方法因其显色强度较低，因此检测灵敏度相对较低，当待测样品中目标物含量较低时易出现假阴性结果，从而无法满足实际应用的要求。近年来，一些新型的信号传导机制被报道用于替代传统ELISA的信号传导机制用于提高ELI SA的灵敏度，如放射免疫分析底物、化学发光底物、荧光底物以及共振胶体金溶液等。然而，发光体系的构建需要充分考虑被检测对象的分子生物学性质，例如在方法层面，抗体的包被及其与抗原的结合性能，选用何种标记物酶及其与抗体的偶联方法，显色底物的选择以及具体发光方法;在效果层面，既要保证显色反应的灵敏性，又应满足显色强度与目标物含量的线性关系。因此，针对沙门氏菌的ELISA检测方法，尤其以提升其检测灵敏性为目的的方法改进，具有突出的技术难度。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供，以解决现有技术的沙门氏菌ELISA检测方法精度较低。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术用于沙门氏菌抗原检测的ELISA方法中，标记抗体的酶灵敏性较低。本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术用于沙门氏菌抗原检测的ELISA方法中，显色系统灵敏性较低。本专利技术要解决的又一技术问题是当采用触酶ClOO作为抗体标记酶对沙门氏菌抗原执行ELISA检测时，具体工艺方法并不明确。本专利技术要解决的又一技术问题是当采用触酶ClOO作为抗体标记酶、采用双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点作为底物对沙门氏菌抗原执行ELISA检测时，检测结果与抗原浓度的线性关系不佳。本专利技术要解决的又一技术问题是当采用触酶ClOO作为抗体标记酶、采用双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点作为底物对沙门氏菌抗原执行ELISA检测时，过程中洗涤效果不佳。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案:—种针对沙门氏菌的检测方法，该方法属于双抗夹心酶联免疫法，该方法是针对沙门氏菌抗原的检测，该方法中用于标记抗体的酶是触酶C100。作为优选，该方法中底物包括双氧水和巯基丙酸修饰的碲化镉量子点。其中双氧水作为碲化镉量子点荧光淬灭剂，反应过程中，双氧水在触酶作用下分解，从而降低荧光淬灭作用，实现发光。作为优选，该方法包括以下步骤:I)包被沙门氏菌抗体；2)取步骤I)包被后的抗体，与待测样品混合后于35?39°C避光环境中反应40?80min，洗涤；3)而后加入生物素化的沙门氏菌多克隆抗体混合，于35?39°C避光环境中反应40?80min，洗涤；4)而后加入链霉亲和素标记的触酶ClOO混合，于35?39°C避光环境中反应40?80min，洗涤；5)而后加入浓度为8?12ymol/L的双氧水溶液混合，于35?39°C避光环境中反应20?40min;6)而后加入巯基丙酸修饰的碲化镉量子点混合，于室温避光环境中反应10?20min；7)检测步骤6)产物的荧光强度。该荧光强度即用于反应待测样品中沙门氏菌含量，实际操作中可利用已知浓度且呈梯度分布的多组沙门氏菌标准液通过以上方法绘制荧光强度-菌浓度标准曲线，再利用待测样品的荧光强度从标准曲线中计算待测样品的沙门氏菌含量。具体操作方法可以依据本
的一般技术常识任一选择。上述梯度分布的多组沙门氏菌标准液，可以分别选择 11CFlVmU 102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、106CFU/mL。该优选技术方案中，步骤2)用于获得固相的抗原抗体复合物;步骤3)实现生物素化的沙门氏菌多克隆抗体与固相的抗原抗体复合物之间的连接;步骤4)利用生物素-链霉亲和素系统实现与触酶ClOO的连接;步骤5)酶催化双氧水分解;步骤6)实现显色反应。在该优选技术方案中:各试剂在使用前可以先可以先于室温平衡30min以上再使用;步骤2)中待测样品的加入量优选为80?120μ!7孔，更优的是lOOyL/孔;步骤3)中生物素化的沙门氏菌多克隆抗体的加入量优选为80?120yL/孔，更优的是10yL/孔;步骤4)中链霉亲和素标记的触酶ClOO的加入量优选为80?120yL/孔，更优的是10yL/孔;步骤5)中双氧水溶液的加入量优选为80?120μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对沙门氏菌的检测方法，该方法属于双抗夹心酶联免疫法，该方法是针对沙门氏菌抗原的检测，该方法中用于标记抗体的酶是触酶C100。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许恒毅，熊勇华，黄小林，赖卫华，熊颖，梁毅，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36