一种禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。所述试剂盒包括10×PCR缓冲液、2.5 U/μl Taq DNA聚合酶、10Mm dNTPs、多重PCR检测引物组、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照物包括肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184基因组DNA；所述阴性对照为灭菌双蒸水。本发明专利技术还公开了一种应用所述试剂盒检测禽源沙门氏菌的多重PCR方法。本发明专利技术方法具有快速、简单、特异性强、灵敏度高的优点，通过一次PCR反应，即可对三种沙门氏菌进行快速检测与分型，相比传统的血清学分型与普通PCR检测，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学检测
，涉及一种禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法，特别涉及血清型为肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。
技术介绍
沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌，主要寄居于人和动物的肠道中，研究表明由沙门氏菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高、危害最广的一种。世界卫生组织（WHO）的调查表明全球每年有1.3×108例人类胃肠炎是由沙门氏菌感染引起的，其中死亡病例高达300万。家禽被认为是沙门氏菌的主要储库，而人类感染通常归因于受污染的家禽制品（包括禽肉与禽蛋）。目前已报道的沙门氏菌血清型总数超过2600种，其中与家禽相关的血清型只占10%，而引起家禽严重感染及食品安全的血清型主要包括肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌三种。肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌主要通过粪口途径感染家禽，经过消化道定植后再侵入包括生殖道在内的多种脏器。因此，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌可以感染鸡蛋进而传播给人类，造成严重的公共卫生问题。与此相反的是，鸡伤寒沙门氏菌属于宿主特异性血清型，可引起各种年龄段鸡发生严重的系统性疾病，给家禽业造成严重的经济损失。由于上述三种血清型沙门氏菌在公共卫生和家禽生产领域的重大影响，肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌已成为全球家禽领域最急需净化的血清型。鉴于上述血清型沙门氏菌对家禽生产与公共卫生的重要性，迫切需要建立一种快速、实用的方法进行特异性检测。由于传统沙门氏菌检测技术上存在诸多缺陷，如：操作步骤烦琐耗时（需依次经过预增菌，选择性增菌，生化与血清学鉴定），不能满足及时有效的质量监测和疾病防控需求；灵敏度较低，当样品中沙门氏菌含量较低时，易造成假阴性结果；准确度不高，尤其是加工后的食品受加热、干燥、高盐和冷冻等因素的作用，易导致沙门氏菌形成营养缺陷型，用传统方法不易检出。为了能够快速、准确、简便的检验上述三种禽源沙门氏菌，以分子生物学为基础的检测鉴定方法在实践检验中不断取得新进展，成为取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一。其中，多重PCR技术在保留了PCR方法敏感、特异、简便、快速等优点的同时，以其高效性成为了多病原同时检测的重要技术之一。但由于多重PCR实验设计较单一PCR更为复杂，在建立多重PCR反应体系时需考虑引物间的相互干扰，还需对其中的主要成分和反应条件进行繁琐的优化，因而限制了该方法的广泛运用。本专利技术根据已知的沙门氏菌全基因组序列，通过分析筛选出肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌三种血清型的特有基因序列，设计多重PCR引物，建立检测方法。该方法可用于禽源样品中肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的特异性检测。
技术实现思路
本专利技术针对传统技术在检测禽源沙门氏菌中存在的不足，提供了一种特异性检测三种重要禽源沙门氏菌血清型（肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）的多重PCR试剂盒及其非诊断性检测方法。本专利技术技术方案如下：本专利技术提供了一种禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒包括10×PCR缓冲液、2.5U/μlTaqDNA聚合酶、10MmdNTPs、多重PCR检测引物组、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照物包括肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184基因组DNA；所述阴性对照为灭菌双蒸水。进一步的，所述多重PCR检测体系的组分为：每25μl反应液中包括10×PCR缓冲液2.5μl、dNTPs2μl、TaqDNA聚合酶0.25μl、检测引物组3μl、DNA模板1~2μl以及适量的灭菌双蒸水。进一步的，所述多重PCR检测方法的制作方法程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s；共30个循环，最后72℃延伸8min。进一步的，所述10×PCR缓冲液含有100mMKCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mMTris-HCl、15mMMgCl2和0.5％Tergitol-typeNP-40。进一步的，所述阳性对照中肠炎沙门氏菌的扩增引物序列为SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示，鸡伤寒沙门氏菌的扩增引物序列为SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示，鼠伤寒沙门氏菌的扩增引物序列为SEQIDNO.8、SEQIDNO.9所示。进一步的，所述肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的引物对浓度均为10μM，等体积混合后得到检测引物组。进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。更进一步的，一种使用禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板。S2：多重PCR扩增，将10×PCR缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、检测引物组以及DNA模板加入无菌PCR反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用PCR仪进行扩增反应；采用2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术根据三种禽源沙门氏菌（肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌）含有的特异基因序列设计引物，具有灵敏度高，特异性强的优点，同时，本专利技术通过一次反应，即可对三种家禽主要优势血清型沙门氏菌进行快速检测与分型，相比传统的血清学分型与普通PCR检测，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。附图说明图1为实施例1中多重PCR检测方法的凝胶电泳展示图。图中：M为DL-500marker，泳道1-3分别为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌，泳道4为阴性对照；图2为实施例2中多重PCR检测方法特异性评价实验凝胶电泳结果图。图中：M为DL-500marker；泳道1-39为沙门氏菌标准株检测结果，分别为纽波特沙门氏菌ATCC6962、蒙特维的亚沙门氏菌ATCC8387、圣保罗沙门氏菌CICC21486、波茨坦沙门氏菌CICC21500、布洛克利沙门氏菌CICC21489、鸡伤寒沙门氏菌ATCC10398、海德尔堡沙门氏菌CMCC50111、肯塔基沙门氏菌CICC21488、婴儿沙门氏菌CMCC50348、汤卜逊沙门氏菌CMCC50023、阿贡纳沙门氏菌CICC21586、鸡伤寒沙门氏菌ATCC19945、山夫登堡沙门氏菌CMCC5005本文档来自技高网...

【技术保护点】
禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于：包括多重PCR检测引物组、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和/或鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA；所述阴性对照为灭菌双蒸水。

【技术特征摘要】
1.禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于：包括多重PCR检测引物组、阳性对照
和阴性对照，所述阳性对照包括肠炎沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌和/或鼠伤寒沙门氏菌基因
组DNA；所述阴性对照为灭菌双蒸水。
2.根据权利要求1所述的禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对
照为肠炎沙门氏菌ATCC13076、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、鸡伤寒沙门氏菌ATCC9184基因
组DNA。
3.根据权利要求1所述的禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述多重PCR
检测体系的组分为：每25μl反应液中包括10×PCR缓冲液2.5μl、dNTPs2μl、TaqDNA聚合
酶0.25μl、检测引物组3μl、DNA模板1~2μl以及适量的灭菌双蒸水。
4.根据权利要求1所述的禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述多重PCR
检测引物组包括SEDIDNO2、3、...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚建森，庄林林，陆光武，王成明，沈海玉，盛中伟，张笛，张林吉，束婧婷，俞燕，刘加圣，窦新红，徐步，邹剑敏，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32