本发明专利技术公开了用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对，所述引物对包括上游引物hlyB‑III‑F 和下游引物hlyB‑III‑R，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明专利技术还公开了迟缓爱德华氏菌的hlyB基因序列的扩增方法。本发明专利技术还公开了一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒。本发明专利技术还公开了迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒在鱼类致病菌的检测方面的应用。本发明专利技术还公开了迟缓爱德华氏菌的检测方法。用本发明专利技术的方法可以快速准确地检测无鳞鱼体内或养殖水体是否含有致病菌，做到有针对性的防治鱼病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鱼类致病菌的检测领域，涉及一种鱼类致病菌检测试剂盒以及检测方法，尤其涉及一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒及其应用。
技术介绍
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是革兰氏阴性短杆菌，爱德华氏菌属，由Hoshina在1962年首次报道，是当前水产养殖业中的有着极大危害的病原菌之一。该菌的宿主范围非常广泛，除可以感染多种鱼类外，也有感染两栖类、爬行类和哺乳类(包括人在内)的报道。因此，为了对E.tarda进行及时诊断、监控和防治，建立一种快速、准确、简便的E.tarda检测技术就具有重要意义。常规细菌鉴定方法包括对病原形态、生理生化水平及蛋白质水平等的鉴定，但由于检测灵敏度不高，测试项目较多和费时费力等缺点，不能满足快速检测的要求。近年来随着分子生物学、生化技术的快速发展，新的E.tarda的检测方法得到了应用。目前分别建立了基于hemolysin、fimbrial、gyrB基因的polymerase chain reaction(PCR)检测技术以及E.tarda的间接ELISA检测方法。以上方法较传统的细菌常规鉴定具有快速、特异等优点，但以上方法在应用中受到诸如制备抗原及抗体、需要PCR仪和凝胶电泳等专用设备的制约，在生产中不能得到普及应用。荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，PCR)因其具有的简便、快速、敏感、特异、适于早期和大量样品检测的优点，已在病原检测领域得到了广泛应用。目前对于迟缓爱德华氏菌的检测国内尚没有相关的定量PCR检测技术方面的研究报告。为了及时控制养殖鱼类鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼体内或养殖水体中是否存在致病菌的技术。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供了一种用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对。本专利技术所要解决的第二个技术问题是一种迟缓爱德华氏菌的hlyB基因序列的扩增方法。本专利技术所要解决的第三个技术问题是提供一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒。本专利技术所要解决的第四个技术问题是提供了一种迟缓爱德华氏菌的检测方法。本专利技术的目的是提供用于荧光定量基因扩增法快速检测E.tarda的引物及其应用。
首先通过生物信息学手段，针对E.tarda核苷酸序列具有种间保守及科、属间特异的区域作为引物组的设计区间，最后通过PCR条件优选确定最优条件。技术方案：为实现上述目的，本专利技术提供了用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对，所述引物对包括上游引物hlyB-III-F和下游引物hlyB-III-R，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。上游引物hlyB-III-F：5’-CTGCTGATGTCCACCCTACA-3’；下游引物hlyB-III-R：5’-CGCTGTAAATTCTCCAGCCC-3’。作为优选，本专利技术所采用的上游引物hlyB-III-F和下游引物hlyB-III-R的浓度比是1:1。一种迟缓爱德华氏菌的hlyB基因序列的扩增方法，包括以下步骤：1)生物信息学方法设计引物组及进行引物筛选得到如所述的引物对：2)迟缓爱德华氏菌的hlyB基因的荧光定量PCR检测：迟缓爱德华氏菌基因组DNA的提取，将基因组DNA进行常规PCR检测获得阳性DNA样品；3)以上述的阳性DNA样品为模板，将所述的引物对扩增迟缓爱德华氏菌的基因组DNA序列得到PCR产物；4)PCR扩增产物分析并测序。上述步骤1)通过荧光定量PCR进行引物PCR扩增效率检测从而筛选得到所述的引物对。一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒，它包含所述的引物对。所述试剂盒包括：1)迟缓爱德华氏菌反应液和Taq聚合酶：迟缓爱德华氏菌反应液包括含有dNTPs、buffer、MgC12、SYBR green I、DEPC水及所述的引物对的混合液；2)强阳性对照品：3)临界阳性对照品；4)DNA提取液；5)阴性对照品。其中，上述迟缓爱德华氏菌反应液是由10×buffer，dNTPs、10000×SYBR green I、
DEPC水、引物对的混合物配制而成。本专利技术的DNA提取液为chelex-100。所述的强阳性对照品是重组质粒pBlue-hlyB-I，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。上述的迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒在鱼类致病菌的检测方面的应用。迟缓爱德华氏菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法是实时荧光定量PCR检测方法。上述检测方法具体包括以下步骤：1)提取鱼取样组织的DNA得到样品DNA；2)建立反应体系进行实时荧光定量PCR；3)通过比对标准品实时荧光定量PCR扩增曲线确定是否感染迟缓爱德华氏菌。上述的检测方法，所述步骤2)中的反应体系为：5pmol/μL的上游引物hlyB-III-F 1μL，5pmol/μL的下游引物hlyB-III-R 1μL，样品DNA5μL，5U Taq DNA聚合酶的0.6μL，3μLDEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5uL；所述12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的10×buffer、2μL的10mM dNTP、0.0025μL的10000×SYBR green I以及8μLDEPC水的混合物；所述PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃l0sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点如下：1、首次提供了迟缓爱德华氏菌hlyB荧光定量PCR检测中的专用引物，使利用荧光定量PCR检测对待测样本中的迟缓爱德华氏菌hlyB基因进行检测成为可能。2、本检测方法与迟缓爱德华氏菌其它常规检测方法如细菌的分离培养鉴定、酶联免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，灵敏度和特异性极高，检测效率得到了很大的提高，并且有效的防止了污染。3、本检测方法与迟缓爱德华氏菌的其它常规检测方法，如细菌的分离培养鉴定、酶联免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，本试剂盒可用于操作程序化，适合大面积推广和应用。4、本检测方法不仅能够评价鱼体的迟缓爱德华氏菌感染状况，同时也可用于水体或环境中迟缓爱德华氏菌的检测。综上所述，本专利技术能为快速、准确地检测出迟缓爱德华氏菌提供了保证，对预防疾病，科学用药，和保障鱼类健康提供了保障。依据本专利技术的专用引物的检测方法及试剂盒可用于鱼类主要患病组织(鳃，体表)及水体或环境中迟缓爱德华氏菌hlyB基因的核酸检测，应用前景广阔。附图说明图1是采用三对引物对分别对于迟缓爱德华氏菌的目标靶基因进行扩增后的电泳图；图2是采用三对引物对对迟缓爱德华氏菌及六种非靶标鱼类致病菌的目标靶基因进行扩增后的电泳图；图3是利用第三对引物hlyB-III-F/hlyB-III-R进行的标准品实时荧光定量PCR扩增曲线图；图4是利用第三对引物hlyB-III-F/hlyB-III-R对病鱼DNA样本进行检测PCR扩增曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。以下实施例是为了对本专利技术作进一步详细说明，并非对专利技术的限制。本专利技术的实验方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物hlyB‑III‑F 和下游引物hlyB‑III‑R，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
【技术特征摘要】
1.用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物hlyB-III-F 和下游引物hlyB-III-R，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。2.一种迟缓爱德华氏菌的hlyB基因序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：1）生物信息学方法设计引物组及进行引物筛选得到如权利要求1所述的引物对；2）迟缓爱德华氏菌的hlyB基因的荧光定量PCR检测：迟缓爱德华氏菌基因组DNA的提取，将基因组DNA进行常规PCR检测获得阳性DNA样品； 3）以上述的阳性DNA样品为模板，将权利要求1所述的引物对扩增迟缓爱德华氏菌的基因组DNA序列得到PCR产物；4）PCR扩增产物分析并测序。3.根据权利要求2所述的一种迟缓爱德华氏菌的hlyB基因序列的扩增方法，其特征在于，所述步骤1）通过荧光定量PCR进行引物PCR扩增效率检测从而筛选得到权利要求1所述的引物对。4.一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒，它包含权利要求1所述的引物对。5.根据权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1）迟缓爱德华氏菌反应液和Taq聚合酶：迟缓爱德华氏菌反应液包括含有dNTPs、buffer 、MgC12、SYBR green I、DEPC水及权利要求1所述的引物对的混合液；2）强阳性对照品：3）临界阳性对照品；4）DNA提取液；5）阴性对照品。6.根据权利要求5述的迟缓爱德华氏...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹红，熊凡，张金，李文祥，吴山功，王桂堂，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，武汉转导生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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