本发明专利技术涉及分子疫苗学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌蛋白酶的免疫应用。以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pET259连接，获得质粒pETArl，转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组蛋白酶。本发明专利技术的蛋白酶作为疫苗能够有效地保护牙鲆抵御迟缓爱德华氏菌侵染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及分子疫苗学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌蛋白酶的免疫应 用。
技术介绍
迟缓爱德华氏菌是一种革兰氏阴性细菌，能够感染多种养殖经济鱼类，包 括大菱解、牙解、罗非鱼等。迟缓爱德华氏菌感染鱼类后可诱发迟缓爱德华氏菌病 (edwardsielosis)，该病可导致被感染鱼类的爆发性大量死亡，由此对养殖业造成严重经 济损失。虽然针对迟缓爱德华氏菌的疫苗研究近年来已有多个报道，但是迄今为止国内对 迟缓爱德华氏菌病尚无有效防范措施。另外，一种疫苗往往难W达到理想的保护效果，针对 病原不同祀点的多种不同疫苗交叉使用有可能取得更好的效果，因此需要研发多种不同的 迟缓爱德华氏菌疫苗。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： 一种迟缓爱德华氏菌蛋白酶，W迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F1/R1为引物进 行PCR扩增，PCR产物与载体祀T259连接，获得质粒祀TArl，转化大肠杆菌化21 〇)E3)即可 表达重组蛋白酶。 所述引物为F1 ;5' -GCCATTAATATGTTTAATTTGCTTGGTTATATTTATTAC-3' ；R1 ;5'-GCC CTCGAGTTCAAAGGGGAAGATCTCCG-3'; 所述蛋白用于制备免疫疫苗本专利技术具有如下优点：[000引1.显著保护性。本专利技术的迟缓爱德华氏菌蛋白酶作为疫苗对迟缓爱德华氏菌的免 疫保护效率达53%。 2.本专利技术的疫苗无需商业化佐剂。【附图说明】 图1为本专利技术实施例提供的纯化的蛋白酶（泳道2)的电泳图。泳道1，分子量标 准。 图2为本专利技术实施例提供的纯化的蛋白酶的酶活检测图。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而 非W任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所设及到的常规性实验方法均采用如 下方法：[001引 1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用"天根生化科技（北京）有限公司"的相 应试剂盒。 2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用化n址an方法（Sambrookand Russell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratory Press2001)； 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"北京，纽英伦生物技术有限公司"。 实施例1 重组迟缓爱德华氏菌蛋白酶rArl的制备 [001引步骤1)rArl的表达载体祀TArl的构建； 迟缓爱德华氏菌蛋白酶Arl的序列已被报道（GenBankaccessionnumber. YP_003296070. 1)。Arl由450个氨基酸组成，有一个保守的肥XXH结构域。祀TArl的构 建如下；W迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用引物F1/R1扩增Arl基因。PCR条件为；94°C 6〇3预变性模板0臟，然后94^4〇3,53^6〇3,72^6〇3,5个循环，然后94^4〇3,61^ 603,721：603,30个循环。？〇?产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体祀1259(961259 构建过程参见HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysisofa ferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol 2010 ;28:678-86)用限制性内切酶Swal酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连 接，连接液转化入大肠杆菌D册a，在含卡那霉素巧Oug/ml)的LB培养基上培养18 - 24小 时，筛选转化子提取质粒，即为祀TArl。 所述LB组成成分按重量百分比计；1.0 %蛋白腺，0.5%酵母粉，1.0 %氯化 钢，97. 5 %蒸馈水； 所述菌株TX1保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、CGMCC，保 藏编号为；CGMCCNo. 2330,保藏日期为2008年1月9日，保藏单位地址为北京市朝阳区大 屯路，中国科学院微生物研究所；分类命名为迟缓爱德华氏菌巧dwardsiellatarda)。 所述引物为FI;5' -GCCATTAATATGTTTAATTTGCTTGGTTATATTTATTAC-3' ；R1 ;5'-GCC CTCGAGTTCAAAGGGGAAGATCTCCG-3'。[002引步骤2)重组迟缓爱德华氏菌蛋白酶rArl的诱导表达和纯化： 将上述步骤1)质粒祀TArl用常规方法转化大肠杆菌化2UDE3)(购自于"天根 生化科技有限公司"，北京），在含有卡那霉素巧Oug/ml)的LB固体培养基上培养18 - 24 小时，挑取转化子，将其命名为化21/pETArl。将化21/pETArl于含有卡那霉素巧Oug/ml) 的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液，加入100ml新鲜的含有卡那霉素 (50ug/ml)的LB液体培养基中，于37°C下转速20化pm摇动培养至ODecici为0.6,加入终浓度 为ImM的IPTG，37°C继续W转速160巧m摇动培养4 - 5h，而后W5000g，4°C离屯、lOmin，收 集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌 液Wl〇〇〇〇g，4°C离屯、30min，回收上清。将上清中的蛋白用HisTrapHPColumns(购于 美国GEHealthcare公司）回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测巧v/cm电压下电 泳25 - 30min，随后15v/cm电压下电泳2 - 2.化），测定其分子量大小，与rArl吻合（参 见图1)。质谱分析表明纯化的蛋白具有肥XXH结构域的Arl的序列。 所述裂解液含lOmMNa&PCVlOmMTris和8M尿素，pH8. 0。 实施例2 蛋白酶rArl的酶活检测[002引 将上述实施例1纯化的蛋白酶rArl在反应液巧OmMTris-HCl，2. 5mM&1C12,pH 7.5)中稀释至不同浓度的蛋白酶rArl稀释液（lOOuM到600uM);将偶氮酪蛋白在反应液 中稀释至5mg/ml的偶氮酪蛋白稀释液。将不同浓度的蛋白酶rArl稀释夜或反应液（对 照）与等体积的偶氮酪蛋白稀释液混合，25°C温育60min，随后加入10% (W/V)的S氯己酸 400ul，4°C温育30min。温育后12000g离屯、5min，取出上清，测定003日。吸收值。酶活表示 为样品的0035。吸收值除W对照的0D35。吸收值。结果表明纯化的rArl表现出明显的酶活， 并且其活力随着蛋白浓度增高而上升（参见附图2)。 实施例3 蛋白酶rArl作为疫苗的应用 步骤1)佐剂对照液及疫苗混合液的制备。[00对佐剂、佐剂对照液的制备：将5% (质量比）化0H和5% (质量比）Al2(S04)3W2 ; 5体积比混合，将混合物W10,OOOg离屯、5分钟。将沉淀悬浮于PBS中至0. 2mg/ml，即为佐 剂。将PBS与佐剂等体积混合，即为佐剂对照液。[003引疫苗混合液制备；将上述实施例1纯化的蛋白酶rArl在PBS中稀释至本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种迟缓爱德华氏菌蛋白酶，其特征在于：以迟缓爱德华氏菌TX1为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pET259连接，获得质粒pETArl，转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组蛋白酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，周泽军，孙铂光，迟恒，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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