本发明专利技术公开了幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，具体是以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4扩增SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，然后将扩增产物经酶切后连入经同样酶切的pMAL-C质粒中，获得重组表达载体pMAL-C-SP，然后将重组表达载体pMAL-C-SP于大肠杆菌中诱导表达并用Ni2+亲和层析柱和强阴离子交换柱纯化，最后过SephadexG200分子筛，得幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶，利用该方法获得的幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶量大，损失小，具有丝氨酸蛋白酶活性，为研究该蛋白的晶体结构和功能奠定了坚实的基础，同时能作为一种前景广阔的胰酶替代物及药物研发的靶点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体设及幽口螺杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法。
技术介绍
幽口螺旋杆菌是一种单极、多鞭毛、末端纯圆、螺旋形弯曲的细菌。在胃粘膜上皮 细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。幽口螺杆菌是微需氧菌，环境氧要求5~8%，在大气 或绝对厌氧环境下不能生长。大量研究表明，超过90%的十二指肠溃瘍和80%左右的胃溃 瘍，都是由幽口螺杆菌感染所导致的。长期的溃瘍，会导致癌症，因此WK)宣布胃幽口杆菌 为微生物型的致癌物质，也是第一个可致癌的原核生物。 最近研究发现幽口螺旋杆菌的丝氨酸蛋白酶（S巧是一种新型的分泌性细菌毒力 因子，它的同源蛋白也广泛表达于原核生物和真核生物细胞，在蛋白质量控制中发挥重要 作用。SP蛋白除了包含一个丝氨酸蛋白酶结构域，还包括了PDZ结构域，而PDZ与细胞内 的信号传导有关，已有研究发现它与关节炎、癌症都有密切的关系。幽口螺旋杆菌感染后， SP蛋白被细菌分泌到黏膜表面，作用于细胞间粘连蛋白E-ca化erin的胞外段，从而破坏细 胞之间的连接，达到损伤胃黏膜的目的。而E-ca化erin作为细胞连接和癌症抑制的重要蛋 白，它的破坏对胃溃瘍和胃癌的发生和发展起到重要作用。因此，SP蛋白的成功表达纯化 对于研究其结构功能W及与胃癌相关疾病的发生发展具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供幽口螺杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，制备方 法简单，采用细菌体内TEV酶切技术，纯化过程中对酶量和酶活性损失小，能够获得有活性 的幽口螺杆菌丝氨酸蛋白酶。 为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案： 幽口螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，包括如下步骤；WSEQIDNo. 3和SEQID No. 4为引物，SEQIDNo. 2所示的核巧酸序列为模板进行PCR扩增，然后将扩增产物经酶切 后连入经同样酶切的pMkC质粒中，获得重组表达载体pMAkC-SP，然后将重组表达载体 pMAkC-SP于大肠杆菌中诱导表达，接着收集菌体，破碎，离屯、取上清，用Ni"亲和层析柱和 强阴离子交换柱纯化，最后过G200分子筛，即得幽口螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶。 优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌JM109或含有TEV蛋白酶编码基因的大肠杆菌 JM109。[000引优选的，所述诱导表达是在温度为16~37°C条件下用0. 1~Immol/L的IPTG诱 导表达3小时；然后用0. 5M脱水四环素诱导2小时。 优选的，所述诱导表达是在温度为37°C条件下用Immol/L的IPTG诱导表达3小 时。 优选的，所述收集菌体是将菌液在100(K)巧m条件下离屯、10分钟，弃上清，收集沉 淀。 优选的，所述破碎为向收集的菌体中加入细菌裂解液和苯甲基横酷氣至苯甲基横 酷氣的终浓度为Immol/l，超声至溶液变清澈即可；所述细菌裂解液为P服.0、Tris-HCl浓 度为25mM，化C1浓度为300mM的溶液。[001引优选的，所述离屯、为在180(K)巧m条件下离屯、15分钟。 优选的，所述Ni2+亲和层析柱纯化为取上清过Ni"亲和层析柱，先用平衡缓冲液 洗柱3次，再用上样缓冲液洗脱，收集洗脱液；所述平衡缓冲液为P服.0、Tris-HCl浓度为 25mM，化C1浓度为300mM，咪挫浓度为20mM的溶液；所述上样缓冲液为抑8. 0、Tris-肥1浓 度为25mM，化C1浓度为300mM，咪挫浓度为200mM的溶液。 本专利技术的有益效果在于；本专利技术采用细菌体内TEV酶切技术，通过在细菌内酶切 目标蛋白标签，并采用Ni2+柱、离子交换和分子筛纯化SP蛋白，相对于传统标签酶切方式 (MBP柱一酶切一化2+柱一离子交换一分子筛），采用本专利技术的方法能够减少目的蛋白纯化 过程的损失，同时减少纯化的技术流程；同时优化缓冲液，结果显示采用25mMTris-HCl， 300mM化Cl，p服.0的体系，当化Cl浓度低于300mM时，SP出现大量沉淀，无法顺利纯化出 目的蛋白；此外，利用本专利技术的方法制备的丝氨酸蛋白酶具有较强的丝氨酸蛋白酶活性，能 促使肤链分裂，有效降解细胞间粘附分子，与传统上消化细胞的膜酶相比，SP蛋白酶具有更 强的活性，可用于替代商业化的膜酶。【附图说明】 为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图： 图1为幽口螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图 (其中泳道1为DNA分子量标准，泳道2和3为PCR扩增产物）。 图2为重组质粒pMAkC-SP酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图（其中泳道1为DNA分 子量标准，泳道2和3为化〇1和甜al双酶切产物）。[001引图3为pMAkc-SP转化菌表达产物的SDS-PAGE电泳图（其中泳道1为蛋白质分 子量标准，泳道2为未经IPTG诱导的表达产物，泳道3为经IPTG诱导的表达产物，泳道4 为沉淀，泳道5为Ni"亲和层析结果）。 图4为Se地adex-G75分子筛后的蛋白电泳图（其中泳道1为蛋白质分子量标准， 泳道2和3为幽口螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶）。 图5不同纯化方式获得的SP蛋白电泳图（其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道 2为未用含TEV蛋白酶菌株纯化的SP蛋白，泳道3为用含TEV蛋白酶菌株纯化的SP蛋白）。 图6为不同缓冲液纯化的SP蛋白（其中泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2为缓 冲液化C1高于300mM纯化结果，泳道3缓冲液化C1低于300mM纯化结果）。[002引图7为SP酶活性鉴定（a为对照；b，为12小时；C为24小时）。[002引图8为SP酶与膜酶在相同浓度相同时间内的活性对比（a为对照；b为10yg/ml膜酶24小时内消化结果；c为10yg/mlSP酶24小时内消化结果）。【具体实施方式】 W下将参照附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第=版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例1、幽口螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶表达质粒pMAkc-SP的构建 根据化iProt数据库中公开的幽口螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶（S巧氨基酸序列 化niProt:025663,SEQIDNo. 1)和大肠杆菌的密码子偏好优化编码SP的核巧酸序列，优 化后的核巧酸序列如SEQIDNo. 2,然后人工合成SEQIDNo. 2所示核巧酸序列。根据人工 合成的SEQIDNo. 2所示的序列设计扩增SP的引物，具体序列如下：上游引物SP-F;5，-tcccatgggaaaatcttgttttccaaggaatgtcccctc-3' (沈QID No. 3)，下划线为TEV酶切序列；下游引物SP-R;5, -gttctagatcacatcatcatcatcatcattttcaccaaaatg-3,(SEQID No.4)，下划线为化is序列。 设计的引物及人工序列委托上海生工生物工程技术服务公司进行合成。 W人工合成的SP序列为模板，采用引物SP-F和SP-R进行PCR扩增，扩增条件为； 先94°C预变性2分钟，再94°C变性30秒、65 °C退火30秒、72 °C延伸Imin，共33个循环，最 后72°C延伸10本文档来自技高网...
【技术保护点】
幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为引物，SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为模板进行PCR扩增，然后将扩增产物经酶切后连入经同样酶切的pMAL‑C质粒中，获得重组表达载体pMAL‑C‑SP，然后将重组表达载体pMAL‑C‑SP于大肠杆菌中诱导表达，接着收集菌体，破碎，离心取上清，用Ni2+亲和层析柱和强阴离子交换柱纯化，最后过G200分子筛，即得幽门螺旋杆菌丝氨酸蛋白酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘东，刘威，吴玉章，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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