本发明专利技术提供一种可针对幽门螺旋杆菌四种关键黏附因子的多表位疫苗，其活性是一条多肽，主要由尿素酶A和B亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位或区段以及霍乱毒素B亚基构成。本发明专利技术通过基因合成技术合成一个人工基因，其包含尿素酶A和B亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位或区段，将该人工基因与霍乱毒素B亚基的基因序列相偶联，形成一个融合基因。利用大肠杆菌表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得四价黏附因子多表位疫苗。该疫苗能够诱发机体产生针对尿素酶A和B亚基、三种外膜蛋白(Lpp20、HpaA和CagL)的T细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答，可用于防治幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及到一种新型幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表 位疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，Hp)的感染呈全球分布，它与慢性胃炎、消 化性胃溃疡、胃癌和胃黏膜相关组织淋巴瘤（MALT)等胃部疾病相关，被世界卫生组织归为 I类致癌因子。在不同国家之间和同一国家不同地区之间，甚至不同民族之间，Hp感染率存 在明显差异，在发达国家Hp感染率为30 % -50 %，我国属于世界上感染率较高的地区，感染 率高达58. 07%，且呈现明显的家庭聚集现象。目前Hp感染的治疗主要基于抗生素药物疗 法，虽然在临床中已被证明是一种根除Hp感染的有效方法，但抗生素药物疗法存在诸多弊 端：（1)服用药物剂量较大和治疗周期较长，病人的依从性较差。（2)抗生素药物疗法存在 毒副作用。（3)抗生素药物疗法导致Hp耐药性增强。（4)抗生素药物疗法治疗后难以避免 Hp的重复感染。（5)抗生素药物疗法主要是针对有症状的病人，而无症状的病人仍可能发 展为严重的Hp感染性相关胃病。因此，研制有效的预防性或治疗性Hp疫苗，既可诱发特异 性免疫应答预防或根除Hp感染，毒副作用少，又可避免Hp的重复感染，成为国内外学者竞 相研究的一个热点。 幽门螺旋杆菌对胃粘膜屏障的破坏作用主要涉及二种关键因子：（1)黏附因子 (黏附素）：主要指Hp表面的一类蛋白质。Hp可通过黏附因子附着在胃黏膜细胞上，对Hp 的胃部定植起着重要作用。（2)毒力因子：主要指Hp可直接作用于胃黏膜细胞的毒力蛋白， 对胃黏膜细胞起破坏作用。因此，Hp对人类胃部的感染，关键的第一步是通过黏附因子黏 附胃黏膜细胞，而Hp表面的一些关键黏附因子蛋白，主要有Hp尿素酶、黏附素 HpaA、外膜蛋 白Lpp20、CagL等蛋白。幽门螺旋杆菌含有丰富的尿素酶（Ure)，约占全菌体蛋白的5%~ 10%，在Hp内部和表面广泛表达，尿素酶由A和B两个亚单位（UreA和UreB)组成。一般细 菌难以在胃部的高酸环境中存活，但Ure能水解尿素产生氨来中和胃酸，并可对胃黏膜造 成病理性损伤。因此，尿素酶是Hp重要的定植因子和致病因子。幽门螺旋杆菌黏附素 HpaA 是Hp鞭毛鞘膜蛋白，几乎存在于所有临床分离的Hp菌株表面，是Hp主要的黏附因子之一， 且氨基酸序列高度保守，动物实验已证明HpaA是定植的必要因子，是Hp疫苗研制的一种理 想的保护性抗原。Lpp20是Hp的另一种外膜蛋白，有研究表明，Lpp20具有良好的免疫原性 和免疫保护性，天然Lpp20蛋白的分离纯化比较困难，给制备Lpp20亚单位疫苗带来了困 难。CagL为幽门螺杆菌外膜伴侣蛋白的一种，由Hp的细胞毒素相关基因毒力岛（cagPAI) 编码并表达于Hp IV型分泌系统（Type IV secretion system，TFSS)菌毛结构的表面蛋白， 桥联TFSS与靶细胞的特异性黏附，不但能激活整合素依赖的细胞信号通路，还具有与纤维 黏连蛋白相似的功能，能直接诱导鼠成纤维细胞形成黏着斑、刺激AGS细胞的扩散。 本专利技术的思路如下：根据机体对Hp的免疫保护性机制，合理预测和筛选Hp尿素酶 A和B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位或表位区 段和分子内黏膜佐剂CTB，通过生物信息学软件对抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和 多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合理、结构新颖的Hp四价黏附因子多表位 疫苗CFAdE。利用Western Blot、ELISA等多种免疫学方法检测Hp四价黏附因子多表位疫 苗CFAdE的免疫原性和免疫特异性，研究表明Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE能够激发 BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA、CagL)的T细 胞免疫应答和高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。
技术实现思路
本专利技术的第一个方面是提供了一种可针对Hp四种关键黏附因子尿素酶、Lpp20、 HpaA和CagL的Hp四价黏附因子多表位疫苗。 本专利技术的第二个方面是提供了 Hp四价黏附因子多表位疫苗的制备方法。 本专利技术的第三个方面是公布了 Hp四价黏附因子多表位疫苗的用途。 本专利技术的第一个方面是提供了一种针对Hp关键黏附因子尿素酶、Lpp20、HpaA和 CagL蛋白的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。该Hp多价表位疫苗主要由黏附因子多表 位肽FAdE和霍乱毒素 B亚基构成，黏附因子多表位肽FAdE的氨基酸序列如（序列3)所示， Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的整体氨基酸序列如（序列1)所示。 本专利技术的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE具有以下优点：（I)Hp四价黏附因子 多表位疫苗CFAdE将尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的优势抗 原表位或区段和黏膜免疫佐剂CTB科学合理地整合在一起，可激发针对Hp尿素酶A和B双 亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。（2) Hp尿素酶A和B双亚基、外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL蛋白也存在一定的细胞生物学毒性， Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE只含有这4种Hp黏附因子的优势Th和B细胞抗原表位 或区段，避免了其生物学毒性，且能够激发针对这4种Hp黏附因子的高特异性抗体，具有更 高的免疫特异性，防止交叉反应产生的免疫病理性伤害。（3)以Hp尿素酶A和B双亚基、 外膜蛋白Lpp20、HpaA和CagL等制备Hp四价亚单位基因工程疫苗，存在重组蛋白过大，不 易表达、提取、纯化等问题，Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE只含有这4种Hp黏附因子的 优势Th和B细胞抗原表位或区段，相对分子量较小，易于表达、提取及纯化。（4) Hp黏附因 子抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很低，本专利技术的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE 采取"偶联分子内免疫佐剂"和"抗原表位多重拷贝"两种设计思路来增强Hp黏附因子抗 原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的 特异性抗体。 本专利技术的第二个方面是提供Hp四价黏附因子多表位疫苗的制备方法，其技术路 线详述如下： (I)Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE的结构设计 根据机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制，通过生物信息学软件合理筛选Hp 尿素酶A和B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA和CagL)的优势Th和B细胞抗原表位及 分子内黏膜免疫佐剂CTB，并对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和 确定，设计出一个科学合理、结构新颖的Hp四价黏附因子多表位疫苗CFAdE。 (2)重组表达质粒pCznl-CFAdE (含有融合基因 CFAdE)的构建 首先构建一个含有霍乱毒素 B亚基（CTB)基因的重组表达载体pCznl-C ;然后通 过基因合成技术合成一个黏附因子多表位肽FAdE (含有Hp尿素酶A和B双亚基、外膜蛋 白Lpp20、HpaA和CagL的优势抗原表位或区段）的核苷酸序列，并将其插入重组表达载体 pCznl-C中，构建重组表达载体p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种幽门螺旋杆菌四价黏附因子多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由霍乱毒素B亚基(CTB)和黏附因子多表位肽FAdE构成，其氨基酸序列如序列1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭乐，刘昆梅，汤锋，贾伟，李永红，秦玉红，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64
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