本发明专利技术提供一种可针对幽门螺旋杆菌四种关键毒力因子的多表位疫苗，其活性是一条多肽，主要由尿素酶A和B亚基、细胞毒素相关蛋白A、空泡毒素相关蛋白A的优势Th和B细胞抗原表位或区段及中性粒细胞激活蛋白构成。本发明专利技术通过基因合成和分子克隆技术构建一个融合基因，其包含尿素酶、细胞毒素相关蛋白A、空泡毒素相关蛋白A的优势Th和B细胞抗原表位或区段以及中性粒细胞激活蛋白。利用大肠杆菌表达该融合基因，经蛋白纯化后，获得四价毒力因子多表位疫苗。该疫苗可激发机体产生针对尿素酶、细胞毒素相关蛋白A、空泡毒素相关蛋白A和中性粒细胞激活蛋白的T细胞免疫应答和特异性抗体体液免疫应答，可用于防治幽门螺旋杆菌感染相关性疾病。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及到一种新型幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表 位疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎、消化性胃溃疡和十二指 肠溃疡的重要致病因子，与胃癌发生密切相关。幽门螺旋杆菌感染呈世界性分布，在发达国 家，Hp感染率为30%~50%，在我国Hp感染率更加严峻，高达58. 07% (超过6亿人口）， 且呈现明显的家庭聚集性。据统计，每年我国用于Hp感染相关性疾病的医疗费用高达100 亿人民币，仍无法有效控制Hp感染相关性疾病的发生。我国是胃癌的高发区，胃癌年患病 率和死亡率均是世界平均水平的2倍多，每年新增胃癌病例约40万人，造成20~30万人 死亡，居世界首位。目前治疗Hp感染的方法主要基于"三联"药物疗法（成分：质子栗抑制 剂、抗生素和铋剂），存在诸多弊端：（1)抗生素广泛使用，导致Hp耐药菌株日益增多，药物 疗效每况日下，临床上同时使用2种或3种抗生素仍难以将其彻底根治。（2)治疗药物存在 毒副作用。（3)药物治疗难以避免反复治疗，反复感染的尴尬局面。（4)药物价格昂贵，治 疗周期长，病人依从性较差。药物疗法因上述弊端，难以在Hp感染人群中大规模使用，研发 有效的预防性和治疗性Hp疫苗具有很好的市场前景，在美国Hp疫苗已被列为21世纪疫苗 发展的重大项目之一。 幽门螺旋杆菌通过一些黏附因子黏附胃黏膜，然后释放直接可作用于胃黏膜的一 些毒力蛋白（毒力因子），破坏胃黏膜细胞，导致慢性胃炎、消化性胃溃疡和胃癌等疾病的 发生。幽门螺旋杆菌的毒力因子主要涉及以下几类关键蛋白：（1)尿素酶（Ure)。幽门螺旋 杆菌含有丰富的尿素酶，约占全菌体蛋白的5%~10%，在Hp内部和表面广泛表达，敲除尿 素酶的Hp无法黏附胃黏膜。因此，尿素酶在Hp黏附胃黏膜的过程中发挥重要作用，是Hp 一种重要的黏附因子；其次，尿素酶也是Hp -种重要的毒力因子；一般细菌难以在胃部的 高酸环境中存活，但Ure能水解尿素产生氨来中和胃酸，并可对胃黏膜造成病理性损伤。尿 素酶由A和B两个亚单位（UreA和UreB)组成，二者都是Hp疫苗的理想候选抗原。⑵细 胞毒素相关蛋白A(CagA)。CagA是Hp重要的毒力因子之一，可经Cag致病岛编码的IV型 分泌系统（Type IV secretion system，TFSS)注入宿主细胞，通过依赖和或独立于磷酸化 的机制，与宿主细胞中调控细胞生长和运动的多种蛋白相互作用，导致宿主细胞功能异常。 流行病学研究发现，CagA阳性Hp菌株感染比CagA阴性Hp菌株更易增加十二指肠溃疡和 胃癌等严重胃肠疾病发生的危险性。（3)空泡毒素相关蛋白A(VacA)。VacA也是Hp重要的 毒力因子之一，其可通过受体介导的内吞作用进入细胞内，导致细胞内空泡样变性；同时能 在胞浆膜上形成通道，增强极化上皮单层细胞的渗透性，最终导致细胞死亡。（4)幽门螺旋 杆菌中性粒细胞激活蛋白（NAP)。NAP是Hp的主要毒力因子之一，对中性粒细胞、单核细胞 有趋化作用，导致中性粒细胞浸润胃黏膜，并诱导中性粒细胞NADPH氧化酶激活，产生活性 氧中间产物（R0I)，引起黏膜炎症和组织损伤。NAP抗原性强，大多数Hp感染患者产生NAP 抗体。其次，NAP是一种很好的Thl型极化细胞免疫佐剂。 本专利技术的思路如下：根据机体对Hp的免疫保护性机制，合理预测和筛选Hp尿素酶 A和B双亚基（UreA和UreB)、细胞毒素相关蛋白A(CagA)和空泡毒素相关蛋白A(VacA)的 优势Th和B细胞抗原表位或表位区段和Thl型细胞免疫佐剂NAP，通过生物信息学软件对 抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一个科学合 理、结构新颖的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE。利用Western Blot、ELISA等多种免疫 学方法检测Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE的免疫原性和免疫特异性，研究表明Hp四价 毒力因子多表位疫苗FVpE能够激发BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶A和B双亚基、CagA、 VacA和NAP的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体，具有很好的免疫原性和免疫特异性。
技术实现思路
本专利技术的第一个方面是提供了一种可针对Hp四种关键毒力因子尿素酶、CagA、 VacA和NAP的Hp四价毒力因子多表位疫苗。 本专利技术的第二个方面是提供了Hp四价毒力因子多表位疫苗的制备方法。 本专利技术的第三个方面是公布了Hp四价毒力因子多表位疫苗的用途。 本专利技术的第一个方面是提供了一种针对Hp关键毒力因子尿素酶、CagA、VacA和 NAP的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE。该Hp多价表位疫苗主要由Hp尿素酶A和B亚 基、CagA、VacA的优势Th和B细胞抗原表位或区段及中性粒细胞激活蛋白（NAP)构成，Hp 四价毒力因子多表位疫苗FVpE的整体氨基酸序列如（序列1)所示，其整体核苷酸序列如 序列2所示。 本专利技术的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE具有以下优点：（l)Hp四价毒力因子 多表位疫苗FVpE将尿素酶A和B双亚基、CagA和VacA的优势抗原表位或区段和Thl型极 化细胞免疫佐剂NAP科学合理地整合在一起，可激发针对Hp四种关键毒力因子尿素酶A和 B双亚基、CagA、VacA和NAP的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。（2) Hp关键毒力 因子尿素酶、CagA和VacA具有细胞生物学毒性，尤其是CagA和VacA蛋白，其与Hp导致的 慢性胃炎、胃溃疡和胃癌密切相关。Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE只含有尿素酶、CagA 和VacA的优势Th和B细胞抗原表位或区段，避免了其生物学毒性，且能够激发更高特异性 的抗体，防止交叉反应产生的免疫病理性伤害。（3)以尿素酶、CagA、VacA和NAP等制备Hp 四价亚单位基因工程疫苗，存在重组蛋白过大，不易表达、提取、纯化等问题，Hp四价毒力因 子多表位疫苗FVpE只含有尿素酶、CagA和VacA的优势Th和B细胞抗原表位或区段，相对 分子量较小，易于表达、提取及纯化。（4)Hp毒力因子抗原表位肽的分子量很小，免疫原性很 低，本专利技术的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE采取"偶联分子内免疫佐剂"和"抗原表位 多重拷贝"两种设计思路来增强Hp毒力因子抗原表位肽的免疫原性，很好地解决了表位疫 苗免疫原性普遍较低的缺陷，可诱发高滴度的特异性抗体。 本专利技术的第二个方面是提供Hp四价毒力因子多表位疫苗的制备方法，其技术路 线详述如下： (l)Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE的结构设计 根据机体对幽门螺旋杆菌的免疫保护性机制，通过生物信息学软件合理筛选Hp 尿素酶A和B双亚基、CagA和VacA的优势Th和B细胞抗原表位及Thl型细胞免疫佐剂 NAP，并对抗原表位或区段的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数，加以分析和确定，设计出一 个科学合理、结构新颖的Hp四价毒力因子多表位疫苗FVpE。 (2)重组表达质粒pET-FVpE (含有融合基因FVpE)的构建 首先基因合成细胞毒素相关蛋白A优势表位区段基因、空泡毒素相关蛋白A优势 表位区段基因、尿素酶多表位肽基因（UE)，然后通过分子克本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种幽门螺旋杆菌四价毒力因子多表位疫苗，其活性成分是一条多肽，主要由幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白A(CagA)的优势Th和B细胞抗原表位区段、空泡毒素相关蛋白A(VacA)的优势Th和B细胞抗原表位区段、尿素酶A和B亚基的优势Th和B细胞抗原表位肽及中性粒细胞激活蛋白(NAP)构成，其氨基酸序列如序列1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘昆梅，郭乐，汤锋，廖国玲，徐广贤，刘宏鹏，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64
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