金葡菌毒力因子调控蛋白的抗原表位，其特征在于具有序列表中序列１所示的氨基酸序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗原表位及模拟表位，具体涉及金黄色葡萄球菌(金葡菌)毒力因子调控蛋白的两个抗原表位及其模拟表位。本专利技术还涉及与这些表位氨基酸序列一致的多肽在制备抗金葡菌感染药物或疫苗等方面中的应用。
技术介绍
金葡菌是一类常见的革兰氏阳性致病菌，是引起烧伤及战伤感染、肺炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年仅医院内感染金葡菌的人数就超过数百万。目前临床上对金葡菌的治疗多采用联合使用抗生素的办法，但是效果并不理想。由于金葡菌极易产生耐药性且无好的解决方法，常用的许多抗生素对之无效，控制金葡菌感染是临床医学殛待解决的问题之一。金葡菌的主要致病物质是毒素，包括溶血毒素、杀白细胞素、肠毒素等。最新研究表明，金葡菌这些毒力因子的合成是受一种可调节RNA分子，及RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因转录，通过碱基互补调节毒力因子的翻译。在细菌生长的对数早期其RNAIII水平低，但到对数晚期RNAIII水平会增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的蛋白RAP(RNAIIIactivating protein)即RNAIII激活蛋白调节的，故因子RAP又称为金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持续分泌RAP，在RAP达到一定浓度后才有激活毒力因子产生的作用。没有RAP产生的金葡菌本身并不致病。最新研究发现，RAP激活RNAIII的转录是通过一个21KD的蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)介导的，当TRAP蛋白的编码基因被突变失活后，RAP不能够激活RNAIII的转录。TRAP由167个氨基酸组成，具有His激酶活性。TRAP蛋白在金葡菌生长的早期开始磷酸化，在对数生长中期达到最大水平。在RAP作用后，通过自身磷酸化来进行信号传导，从而介导细胞内RNAIII水平上升，加速金葡菌外毒素的分泌(Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，2762658-2667)。由此可见TRAP蛋白在金葡菌的毒素表达调控也起着关键性的作用。2001的研究发现TRAP的抗体可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌(Oleny V，et al.Peptides 2001，221621-1627)。抗原表位作为免疫细胞识别的靶结构和激发特异性免疫应答的物质基础，对于免疫反应的相关研究具有重要意义。抗原缺失突变、合成肽段扫描(PEPSCAN)、X射线晶体衍射等技术的应用，使“抗原表位”的确定成为可能，但这些方法费用高昂，需耗费大量人力、物力，而且不适于复杂表位的研究，因而其应用受到限制。“模拟表位”(mimotope)这一概念的出现，不仅为抗原表位的分析提供了线索，也为疫苗研究的发展开辟了一条新的思路。模拟表位(mimotope)，通常指能够模拟抗原表位的多肽结构，它具有与天然抗原相似的反应原性，与适当的载体偶联后，还可能具有相似的免疫原性，(但在天然抗原中可能并无与之相同或相似的序列或空间结构)。对于一些难以获得或尚不确定的抗原，人们很难甚至无法确定其抗原表位，使相关的研究难以进行。而通过获得“模拟表位”这一径，便有可能解决上述问题。不仅为抗原表位的分析提供了线索，也为疫苗研究的发展开辟了新思路，尤其是推动了构象型表位和非蛋白抗原表位的研究。推动模拟表位研究的一项关键技术，是1985年由Dr.Smith建立并发展的噬菌体展示技术。噬菌体展示肽库的构建是运用噬菌体展示技术，将随机排列的外源肽(通常6～15个氨基酸残基组成)展示在噬菌体表面，构成多样性为107以上的随机肽库。通过亲和纯化的生物淘选过程，从噬菌体肽库中筛选出靶分子(如单克隆抗体、多克隆抗体)的结合肽，将结合肽与天然抗原进行比较，其中有的与天然抗原表位高度同源，有的与天然抗原完全不同，但都具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性，这些结合肽便被称为“模拟表位”。与分析抗原表位的传统方法相比，噬菌体展示技术具有很强的优势，不仅简便、快捷，而且应用范围广泛，适于构象型表位、非蛋白抗原表位以及尚不明确的抗原研究(Zhong G，et al.J Biol Chem 1994，26924183-24188；Mottic etal.Gene 1994，146191-198；Rodriguez L，et al.J Gen Virol 1999，80(Pt3)727-738)。与单克隆抗体相比，以多克隆抗体或抗血清为靶标的筛选过程，难度大，但有明显的优势。表现在首先，靶标容易获得，较制备单克隆抗体时间短、成本低、操作简单；其次，可获得多个抗原表位的模拟表位，筛选效率高，有利于制备具有强免疫原性的复合疫苗。本实验将抗血清进行了免疫亲和层析纯化，去除了非特异抗体，以获得特异性高的筛选分子，有利于筛选到特异的噬菌体克隆，减少非特异克隆的富集。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)的两个抗原表位及其模拟表位。本专利技术的另一目的是提供上述表位或与这些表位氨基酸序列一致的多肽在制备抗金葡菌感染药物或疫苗等方面中的应用。为实现本专利技术的第一个目的，我们以TRAP多克隆抗体为靶标，通过线性肽库筛选获得了两组TRAP蛋白的抗原模拟表位，通过与TRAP蛋白序列比较，发现两个家族的序列都可以在表达序列上找到一致序列，即TRAP蛋白本身的两个抗原表位21-34位氨基酸序列和156-167位氨基酸序列。它们的氨基酸序列如下抗原表位1对应于TRAP蛋白的21-34位氨基酸序列21 NPTHQLFQFSASDT 34抗原表位2对应于TRAP蛋白的156-167位氨基酸序列 156 SYFERYLYPIKE 167本专利技术的金葡菌毒力因子调控蛋白TRAP的两个抗原模拟表位是具有以下氨基酸序列结构模式的多肽抗原模拟表位1XPXHHQHXTGFT抗原模拟表位2SWFDXXLYPXXX上述抗原表位和抗原模拟表位结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即A代表丙氨酸残基，R代表精氨酸残基，N代表天冬酰胺残基，D代表天冬氨酸残基，Q代表谷氨酰胺残基，E代表谷氨酸残基，H代表组氨酸残基，W代表色氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，T代表苏氨酸残基，S代表丝氨酸残基，L代表亮氨酸残基，G代表甘氨酸残基，P代表脯氨酸残基，V代表缬氨酸残基，K代表赖氨酸残基，M代表甲硫氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，X代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的任意一种。上述表位中的有些氨基酸可以根据氨基酸的相似性进行相互替代，如谷氨酰胺残基(Q)，谷氨酸残基(E)，天冬氨酸残基(D)或天冬酰胺残基(N)之间可以相互替代；色氨酸残基(W)，酪氨酸残基(Y)或苯丙氨酸残基(F)之间可以相互替代；赖氨酸残基(K)和精氨酸残基(R)之间可以相互替代；丝氨酸残基(S)和苏氨酸残基(T)之间可以相互替代；丙氨酸残基(A)和甘氨酸残基(G)之间可以相互替代；亮氨酸残基(L)和甲硫氨酸残基(M)之间可以相互替代。本专利技术的小分子多肽可通过化学合成或用基因工程重组表达的方法制得。实验证明，具有上述结构模式的多肽能够与可以特本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵宁生，杨光，柳川，高亚萍，董洁，丁红梅，沈倍奋，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，海南通用同盟药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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