具有增加的比活性的抗血友病因子VIII的新型变体制造技术

本发明专利技术在血友病疗法的领域中。其涉及相较于已知的因子VIII产品具有增加的比活性的抗血友病因子VIII的新型变体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有增加的比活性的抗血友病因子VIII的新型变体专利
本专利技术在凝血因子和血友病的领域中。其涉及在本文中称为rFVIIIv3的抗血友病因子VIII(FVIII)的新变体，该变体相较于已知的因子VIII产品具有增加的比活性。专利技术背景当血小板在损伤位置附着至受伤血管的切壁(cutwall)时，凝血开始。随后，在酶促调节的反应的级联中，可溶性血纤蛋白原分子被酶凝血酶转化成血纤蛋白的不溶性链，其将血小板在血栓中保持在一起。在级联的每一个步骤中，变体前体被转化成在一系列中裂解下一个变体前体的蛋白酶。在大部分步骤中需要辅因子。因子VIII(也称为抗血友病因子VIII或FVIII)作为无活性前体在血液中循环，紧密地非共价地结合至血管性血友病因子(vonWillebrandfactor)。因子VIII被凝血酶或因子Xa蛋白水解激活，所述凝血酶或凝血酶因子Xa使其与血管性血友病因子分离，并且在级联中激活其促凝血功能。活性形式的变体因子VIIIa是使因子IXa向因子X激活的催化效率增加数个数量级的辅因子。人FVIII的克隆已显示变体包含组织在许多结构域(具有顺序A1-A2-B-A3-C1-C2)内的2332个氨基酸(Vehar等人，1984，Nature312，337-342；Toole等人，1984，Nature312，342-347和Wood等人，1984，Nature312，330-337)。大多数FVIII在血浆中是异二聚体，包含轻链和各种重链衍生物。异源二聚体结构归因于前体在精氨酸1648处的蛋白水解性裂解，从而导致分别包含A1-A2-B和A3-C1-C2的重链和轻链。重链内的异质性可通过其羧基末端B结构域内的限制性蛋白水解来解释。为了用作因子X激活的辅因子，FVIII需要通过因子Xa或凝血酶产生的限制性蛋白水解。该激活包括在重链上的位置372和740处和轻链上的位置1689处的精氨酸处的裂解。已确定与无活性前体相比较，活性FVIII辅因子缺乏轻链片段1649-1689和完整的B结构域(Mertens等人，1993)。未利用因子VIII治疗的在因子VIII或针对因子VIII的抗体中具有缺陷的人遭受不受控制的内出血，其可引起一系列严重症状，从关节中的炎症反应至早逝。在美国共计约10,000个严重的血友病患者可通过输注人因子VIII来治疗，如果以充足的频率和浓度施用，这可恢复血液的正常凝血能力。事实上，因子VIII的经典定义是存在于正常血浆中修正来源于患有甲型血友病的个体的血浆的凝血缺陷的物质。几种具有不同程度的纯度的人血浆源性因子VIII的制剂可商购获得用于治疗甲型血友病。此类制剂包括来源于许多供体的混合血液的部分纯化的因子VIII，所述血液针对病毒进行了热处理和去垢剂处理但包含显著水平的抗原性变体；具有更低水平的抗原性杂质和病毒污染的单克隆抗体纯化的因子VIII；和重组人因子VIII。抑制因子VIII的活性的抗体(“抑制剂”或“抑制性抗体”)的产生是血友病患者治疗中的严重并发症。同种抗体(Alloantibody)响应因子VIII的治疗性输注在约20％的甲型血友病患者中产生。在产生抑制剂的先前未治疗的甲型血友病患者中，抑制剂通常在一年的治疗内产生。此外，使因子VIII失活的抗体(自身抗体)偶尔在具有先前正常因子VIII水平的个体中产生。如果抑制剂滴度足够低，则患者可通过增加因子VIII的剂量来治疗。然而，通常地抑制剂滴度是如此之高，以至于其不能被因子VIII压制。可选的策略是在正常止血过程中使用激活的凝血酶原复合物浓缩制剂(例如，KONYNE(CutterLaboratories)、FEIBA(BaxterHealthcare)、PROPLEX(BaxterHealthcare))或重组人因子VIIa来绕过对因子VIII的需要。此外，由于猪因子VIII通常具有比人因子VIII显著更小的与抑制剂的反应性，因此已使用部分纯化的猪因子VIII制剂(HYATE：C(IPSENPharma))。已利用猪因子VIII成功地治疗了许多已产生针对人因子VIII的抑制性抗体的患者，这些患者已长期耐受这样的治疗。然而，关于病毒或其它血液传播污染物的危险的公共卫生问题已限制了从猪血液纯化的猪因子VIII的有用性。因此开发了重组猪因子VIII变体，其被称为“OBI-1”并且描述于例如WO01/68109中。OBI-1是部分B结构域缺失的猪FVIII。该分子目前正处于临床开发中。已知B结构域缺失的因子VIII变体保持因子VIII的前凝血剂和辅因子活性。除此以外，Mertens等人(BritishJournalofHaematology1993，85，133-142)描述了缺乏B结构域和横跨赖氨酸713至精氨酸740的重链序列的重组人因子VIII变体。许多血友病患者需要每天替换因子VIII以阻止出血和所造成的致畸形血友病性关节病(resultingdeforminghemophilicarthropathy)。鉴于此，存在对更具效力的因子VIII分子的需要。专利技术概述在第一方面，本专利技术涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的因子VIII(FVIII)变体、缺乏多达27个氨基酸序列(对应于如图2中描述的猪因子VIII的氨基酸716至742或SEQIDNO：7的氨基酸714至740)的FVIII变体。该27个氨基酸序列NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR(SEQIDNO：10)可部分或完全缺失。在一个实施方案中，本专利技术涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的FVIII变体，FVIII变体缺乏多达27个氨基酸的序列，该序列对应于如图2中描述的猪因子VIII的氨基酸716至742或SEQIDNO：7的氨基酸714至740，其中可缺失27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在另一个实施方案中，可缺失27、26、25、24、23、22、21或20个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失27、26或25个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失对应于DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIEPR(SEQIDNO：10)的27个氨基酸。在一个实施方案中，本专利技术涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的FVIII变体，FVIII变体缺乏多达27个氨基酸的序列，该序列对应于如图2中描述的人因子VIII的氨基酸716至742或SEQIDNO：8的氨基酸714至740，其中可缺失27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失27、26、25、24、23、22、21或20个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失27、26或25个氨基酸。在另一个实施方案中，缺失对应于NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPR(SEQIDNO：11)的27个氨基酸。在另一个实施方案中，本专利技术涉及分离的重组的完全或部分B结构域缺失的猪FVIII变体，该变体完全缺乏对应于DIGDYYDNTYEDIPGFLLSGKNVIE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.11.05 US 61/410,4371.一种分离的且重组的猪因子VIII(FVIII)变体，所述FVIII变体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的FVIII变体。3.一种表达载体，其包含根据权利要求2所述的多核苷酸。4.一种哺乳动物细胞，其包含根据权利要求3所述的表达载体。5.一种用于产生FVIII变体的方法，其包括步骤：a.培养根据权利要求4所述的哺乳动物细胞；和b.从所述哺乳动物细胞分离FVIII变体。6.根据权利要求5所述的方法，其还包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎志刚，R·K·斯塔福德，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特保健股份有限公司，
类型：
国别省市：