复合物制造技术

本发明专利技术涉及血管性血友病因子(VWF)与因子VIII的共价复合物，其中所述复合物经修饰而具有延长的体内半衰期。本发明专利技术进一步涉及生产所述复合物的方法，以及该复合物用于治疗或预防出血事件的治疗性或预防性用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及血管性血友病因子或其变体(VWF)与因子VIII或其变体(因子VIII)的共价复合物，其中所述复合物经修饰而具有延长的体内半衰期。本专利技术进一步涉及生产所述复合物的方法，以及该复合物用于治疗或预防出血事件的治疗性或预防性用途。血液凝集因子缺乏可引起多种出血障碍。最常见的障碍包括A型和B型血友病，其分别由血液凝集因子VIII和因子IX的缺乏造成。血管性血友病则是另一种已知的出血障碍。在血浆中，因子VIII(FVIII)大多以与血管性血友病因子的以非共价复合物的形式存在。原肽切割后形成的成熟FVIII为由多达2332个氨基酸构成的多肽，其由若干结构域组成，如图1中所示。FVIII在凝血中的功能为加速因子IXa依赖的X因子向Xa因子的转化。由于FVIII和血管性血友病因子形成复合物，所以长期以来人们认为FVIII和血管性血友病因子的功能是同一分子的两种功能。到了70年代才清楚FVIII和血管性血友病因子是分开的分子，只是在生理条件下形成复合物。80年代，人们确定了FVIII和血管性血友病因子的解离常数为约0.2nmol/L(Leyte等人,BiochemJ1989,257:679-683)，并确定了两个分子的DNA序列。典型血友病，或称为A型血友病是一种遗传性出血障碍。其由X染色体连锁的血液凝集因子FVIII缺乏导致，几乎只在男性中发生，几率为每10,000人中1-2人。该X染色体缺陷是由自身不是血友病患者的女性携带者递送下来的。A型血友病临床表现为增加的出血倾向。在引入FVIII浓缩物进行治疗前，患有严重血友病的患者平均寿命不到20岁。使用来自血浆的FVIII浓缩物显著改善了A型血友病患者的状况，极大地增加了平均平均寿命，使其中大多数和患者有可能过上差不多正常的生活。然而，源于血浆的浓缩物及其用途存在特定问题，其中最严重的问题为病毒传播，如引起乙型肝炎、非甲非乙型肝炎以及HIV的病毒。然而，近年开发了不同的病毒灭活方法及新型高度纯化的FVIII浓缩物为血浆来源的FVIII建立了非常高的安全标准。接受预防性FVIII治疗的严重A型血友病患者需要每周静脉(i.v.)施用约三次，这是因为FVIII的血浆半衰期只有约12小时。每次i.v.施用是繁琐的，伴随着疼痛，并具有感染的风险，特别是当由患者自身在家中进行或由被诊断患有A型血友病的患儿父母进行时。因此，非常需要创造一种具有增加的功能半衰期的FVIII，使得能够制造更低频率施用的含FVIII的药学组合物。已经做出一些尝试来延长FVIII的功能半衰期，如通过减少其与细胞受体的相互作用(WO03/093313A2、WO02/060951A2)，通过将聚合物与FVIII共价连接(WO94/15625、WO97/11957和US4970300)，通过将FVIII胶囊化(WO99/55306)，通过引入新型金属结合位点(WO97/03193)，通过用肽键(WO97/40145和WO03/087355)或二硫键(WO02/103024A2)将A2结构域共价连接至A3结构域，或通过引入防止凝血酶活化后在A1和A2结构域间进行切割从而保持A1结构域与A2结构域间的共价连接的突变(WO2006/108590)。另一种增强FVIII或血管性血友病因子的功能半衰期的方法是将FVIII进行PEG化(WO2007/126808、WO2006/053299、WO2004/075923)或将血管性血友病因子进行PEG化(WO2006/071801),其中的想法是PEG化的血管性血友病因子具有增加的半衰期，也会间接地增强血浆中存在的FVIII的半衰期。此外，还有人描述了FVIII与半衰期增强多肽如白蛋白或免疫球蛋白Fc的恒定区的融合蛋白(WO2004/101740、WO2008/077616和WO2009/156137)。血管性血友病因子在不同形式的血管性血友病(VWD)中有缺失、功能缺陷或量减少的情况，其是一种多聚的粘性糖蛋白，存在于哺乳动物的血浆中，其具有多重生理学功能。在初期止血(primaryhemostasis)过程中，血管性血友病因子在血小板表面上的特定受体与细胞外基质组分如胶原蛋白之间扮演“协调者”的作用。此外，血管性血友病因子是促凝血FVIII的携带者，并稳定该蛋白质。血管性血友病因子在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。野生型VWF的氨基酸序列与cDNA序列公开于Collins等人1987,ProcNatl.Acad.Sci.USA84:4393–4397。所述前体多肽，前体血管性血友病因子原由22残基的信号肽、741残基的原肽以及存在于成熟的血浆血管性血友病因子中的2050残基的多肽构成(Fischer等人,FEBSLett.351:345-348,1994)，也参见图2中血管性血友病因子原及成熟血管性血友病因子单体单元。当信号肽在内质网中切割时，两个单体血管性血友病因子之间形成C末端的二硫桥。在其通过分泌途径的进一步运输过程中，加上12个N-连接和10个O-连接的碳水化合物侧链。更重要地，血管性血友病因子二聚体经N-末端的二硫桥多聚化，而741个氨基酸长的原肽在晚期高尔基体中被PACE/弗林蛋白酶所切割。原肽及血管性血友病因子的高分子量多聚体(VWF-HMWM)储存于内皮细胞的Weibel-Pallade小体中或血小板的α-粒细胞中。一旦分泌入血浆中，蛋白酶ADAMTS13会在血管性血友病因子的A2结构域内部切割超大的血管性血友病因子多聚体。血浆血管性血友病因子由全范围的多聚体组成，从近似500kDa的单个二聚体到分子量超过10,000kDa的由高达或超过20个二聚体构成的多聚体。VWF-HMWM具有最强的止血活性，可通过瑞斯托霉素辅助因子活性测定(VWF:RCo)而测量。VWF:RCo/血管性血友病因子抗原的比率越高，高分子量多聚体的相对量则越高。血管性血友病因子缺陷是血管性血友病(VWD)的起因，该病的特征为或多或少都有显著的出血表型。3型VWD是最严重的形式，其中血管性血友病因子基本上完全缺失，1型VWD涉及血管性血友病因子的水平减少，其表型可以非常温和。2型VWD与血管性血友病因子的性质缺陷有关，可与3型VWD一样严重。2型VWD有很多子形式，其中一些与高分子量多聚体的缺失或减少有关。2A型VWD的特征为中间体和大的多聚体同时缺失，本文档来自技高网...

【技术保护点】
共价连接的复合物，其包含血管性血友病因子或其变体(VWF)及因子VIII或其变体(因子VIII)，所述复合物包含半衰期延长部分，前提是其不是一个Fc单体连接至VWF且另一个Fc单体连接至因子VIII的异源二聚体Fc融合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.22 EP 13164728.11.共价连接的复合物，其包含血管性血友病因子或其变体(VWF)
及因子VIII或其变体(因子VIII)，所述复合物包含半衰期延长部分，
前提是其不是一个Fc单体连接至VWF且另一个Fc单体连接至因子
VIII的异源二聚体Fc融合物。
2.权利要求1的共价连接的复合物，其中共价连接不是由半衰期
延长部分提供。
3.权利要求1或权利要求2的共价连接的复合物，其中因子VIII
经修饰使得其与VWF形成二硫桥。
4.权利要求3的共价复合物，其中通过用半胱氨酸残基置换天然
存在的氨基酸或插入半胱氨酸残基而修饰因子VIII，所述半胱氨酸残
基与VWF中的半胱氨酸残基形成二硫桥。
5.权利要求4的复合物，其中因子VIII中被置换的天然存在的氨
基酸选自因子VIIIa3结构域中的氨基酸。
6.权利要求4或权利要求5的复合物，其中因子VIII中被置换的
天然存在的氨基酸位于因子VIIIa3结构域的氨基酸1653-1660中或氨
基酸1667-1674中或氨基酸1675-1688中，或者将半胱氨酸引入FVIII
a3结构域的氨基酸1653-1660或氨基酸1667-1674或氨基酸1675-1688
的序列中。
7.权利要求3的复合物，其中因子VIII中被置换的天然存在的氨
基酸位于C末端结构域中。
8.权利要求1-7中任一项的复合物，其中通过用半胱氨酸残基置
换天然存在的氨基酸或插入半胱氨酸残基而修饰VWF，所述半胱氨
酸残基与引入因子VIII中的半胱氨酸残基形成二硫桥。
9.权利要求8的复合物，其中VWF中的天然存在的氨基酸为D’
或D3结构域中的氨基酸，或其中半胱氨酸残基的插入在D’或D3结
构域中。
10.权利要求8或权利要求9的复合物，其中将半胱氨酸残基插入
TIL′结构域、E′结构域、D3结构域、C8-3结构域、TIL-3结构域或
E-3结构域，或者VWF中用半胱氨酸残基置换的天然存在的氨基酸为
TIL′结构域、E′结构域、D3结构域、C8-3结构域、TIL-3结构域或
E-3结构域中的残基。
11.权利要求1-10中任一项的复合物，其中VWF包含FVIII结
合结构域或由FVIII结合结构域组成。
12.前述任意权利要求的复合物，其中因子VIII经修饰而包含
VWF的一个或多个结构域。
13.权利要求12的复合物，其中因子VIII经修饰而包含VWF的
C末端结构域CK。
14.权利要求13的复合物，其中因子VIII经修饰而还包含VWF
结构域C6、或C5和C6、C3至C6、或结构域C1至C6中的任意一
个或多个、或其变体。
15.权利要求12-14中任一项的复合物，其中因子VIII包含SEQ

\tIDNO:2中残基2724-2812或其变体，前提是保留半胱氨酸残基2773
(或其对等物)。
16.权利要求13-15中任一项的复合物，其中C末端VWF结构域
通过可切割连接子连接至因子VIII。
17.权利要求16的复合物，其中可切割连接子包含因子VIII的凝
血酶切割位点之一。
18.权利要求16或权利要求17的复合物，其中连接子序列包含其
他的氨基酸残基，以提供长度足以允许因子VIII和VWF分别...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·梅岑，S·舒尔特，T·韦默，
申请(专利权)人：杰特有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU