本发明专利技术公开了一种龋齿疫苗，所述龋齿疫苗是通过将所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列插入到所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的下游3’端或替代全部的所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的高变域，然后与变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列连接后共表达而成的重组蛋白。通过建立一种治疗性龋齿疫苗的大鼠模型，以变形链球菌毒力因子PAc、Glu为疫苗抗原、重组细菌鞭毛素蛋白（KF）为粘膜佐剂，系统研究比较了PAc、KF-PAc、KFD2-PAc-Glu的免疫应答效应和抗龋保护效应，结果显示KFD2-PAc-Glu是相对最好的治疗性疫苗，即本发明专利技术所述龋齿疫苗是相对最好的治疗性疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种疫苗，具体来说涉及。
技术介绍
龋齿是一种由细菌感染引起的慢性感染性疾病，存在范围广，对健康危害巨大。针对龋齿预防所采用的措施主要有两个方面:加强口腔公共卫生和使用防龋疫苗。随着对龋病危害性认识的逐步提高，抗龋疫苗的研究得到越来越多的关注，并将成为未来有效控制離齿的重要手段。经过数十年的深入研究，变形链球菌(SirejO1cocciAS mu tans (S.已被确认为主要的致龋病原菌，其致病机制是:细菌在牙表面粘附、富集后，代谢产生的乳酸使牙釉质脱钙，进而侵害牙本质和牙髓形成龋坏。在龋坏形成过程中，变形链球菌表面蛋白(PAc)和葡糖基转移酶(GTFs)分别在变形链球菌粘附和富集过程中起主要作用。在前期研究过程中，我们发现将PAc作为抗原与大肠杆菌K12株来源的重组鞭毛素进行融合表达(KF-PAc及KFD2-PAC)，可作为龋齿的预防性疫苗，该研究已获得中国授权专利(龋齿疫苗及制备方法，专利号=ZL 201110438088.1，授权日期:2014年9月)。GTFs具有催化和结合葡聚糖的功能，其催化功能区主要位于N端的三分之一处，C端的重复序列与其葡聚糖结合功能相关。本专利在前期工作的基础上，将GTFs的葡聚糖结合结构域(Glu)融合在KFD2-PAc的C端，制备了一种新型的重组融合蛋白一KFD2-PAc-Glu。以往的大鼠龋齿模型是在大鼠完成口腔定菌前、后3-5天进行免疫干预，然后评价保护效果，因而只能称为预防性龋齿疫苗大鼠模型。而本专利建立了一种治疗性龋齿疫苗大鼠模型:在大鼠接菌完成后56天(8周)、业已发展成龋齿后，再进行免疫干预并评价治疗效果。因为龋患是一种慢性疾病、在任何年龄层次均可发生。因而这种模型更能模拟人体环境、更好的评价疫苗的效果。本专利利用这个治疗性龋齿疫苗大鼠模型，系统研究比较了 PAc、KF-PAc、KFD2-PAc-Glu的免疫应答效应和抗龋保护效应，结果显示KFD2-PAc-Glu是相对最好的治疗性疫苗，即本专利技术所述龋齿疫苗是相对最好的治疗性疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种龋齿疫苗，本专利技术还提供了一种所述龋齿疫苗的制备方法。为实现上述目的，所采取的技术方案:一种龋齿疫苗，所述龋齿疫苗是通过将所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列插入到所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的下游3’端或替代全部的所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的高变域，然后与变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列连接后共表达而成的重组蛋白。优选地，所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分组成；所述变形链球菌表面蛋白PAC派生的抗原的DNA序列包含至少一个抗原表位。优选地，所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列由SEQ ID NO: 2组成。优选地，变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列由SEQ ID NO: 3或SEQID NO:3的部分组成；变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列包含至少一个抗原表位。优选地，所述龋齿疫苗DNA序列如SEQ ID NO:4组成。这里所述的龋齿疫苗称为KFD2-PAc-Gluo优选地，所述共表达的方式为原核表达。优选地，所述共表达的载体为pET28a载体。本专利技术提供了一种上述所述的龋齿疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤: 将所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列插入到所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的下游3’端或替代全部的所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的高变域，然后与变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列连接后共表达出所述龋齿疫苗。本专利技术还提供了一种龋齿疫苗组合物，所述龋齿疫苗组合物包括上述所述的龋齿疫苗和药学上可接受的载体。本专利技术还提供了上述所述的龋齿疫苗在制备预防或治疗由变形链球菌感染引起的龋齿的药物中的用途。本专利技术的有益效果在于:本专利技术建立了一种治疗性龋齿疫苗的大鼠模型，.以重组变形链球菌毒力因子PAc、重组葡糖基转移酶(Glu)为疫苗抗原、重组细菌鞭毛素蛋白(KF)为粘膜佐剂，系统研究比较了 PAc、KF-PAc、KFD2-PAc-Glu的免疫应答效应和抗龋保护效应，结果显示KFD2-PAc-Glu是相对最好的治疗性疫苗。【附图说明】图1为本专利技术的实施例1中的pET28a-KFD2-PAc-Glu质粒构建的示意图； 图2为本专利技术的实施例1中纯化了的PAc，KF-PAc和KFD2_PAc_Glu的SDS-PAGE图；图3为本专利技术的实施例1中纯化了的PAc，KF-PAc和KFD2_PAc_Glu的TLR5激活活性验证； 图4为本专利技术的实施例1中大鼠龋齿模型的龋坏进展图，(A)大鼠龋齿模型的龋坏进展观察的实验流程图；(B)離坏进展的凯斯(Keyes)得分:E，釉质離；Ds，浅表牙本质離；Dm，中度牙本质龋；Dx，重度牙本质龋；(C)大鼠龋坏进展的整体得分=E+Ds+Dm+Dx;数据表示为均值均值土标准差；(D)大鼠龋坏进展的代表性龋损图片； 图5显示了治疗性龋齿疫苗实验大鼠模型的实验流程；四组大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ;(2)5 微克 PAc ; (3 ) 8.5 微克 KF-PAc; (4)9 微克 KFD2-PAc_Glu ； 图6为本专利技术的实施例1中四组大鼠磨牙的不同龋坏程度的凯斯(Keyes)得分，数据表示为均值均值土标准差；四组大鼠滴鼻免疫:(I) PBS ; (2) 5微克PAc ; (3) 8.5微克KF-PAc; (4)9 微克 KFD2-PAc-Glu ； 图7为本专利技术的实施例1中四组大鼠龋坏的整体得分，数据表示为均值均值土标准差；四组大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ; (2) 5微克PAc ; (3) 8.5微克KF-PAc; (4) 9微克KFD2-PAc-Glu ； 图8为本专利技术的实施例1中相对于PBS组，其他免疫组的防龋保护力，数据表示为均值均值土标准差；图9为本专利技术的实施例1中PAc特异性的抗体滴度:A、血清IgG，B、血清IgA，C、唾液IgA;四组大鼠滴鼻免疫:(I)PBS ; (2) 5微克PAc ; (3) 8.5微克KF-PAc; (4) 9微克KFD2-PAc-Glu ;其中数据表示为均值 ± 标准差;*，P〈0.05 ;** P〈0.01 ;_，P〈0.001 ；图10为本专利技术的实施例1中龋齿积分与PAc特异性抗体相关性分析:A、血清IgG，B、血清IgA, C、唾液IgA -M组大鼠滴鼻免疫:(I) PBS ; (2) 5微克PAc ; (3) 8.5微克KF-PAc;(4)9微克KFD2-PAc-Glu。其中每个点代表一只大鼠的数据； 图11为本专利技术的实施例1中Glu特异性的抗体滴度:A、血清IgG，B、血清IgA ;四组大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ；(2) 5 微克 PAc ； (3) 8.5 微克 KF-PAc; (4)9 微克 KFD2-PAc_Glu。【具体实施方式】为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，本专利技术中PA和KF-Pac蛋白的表达，pET28a-KFD2-Pac的建本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种龋齿疫苗，其特征在于，所述龋齿疫苗是通过将所述变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原的DNA序列插入到所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的下游3’端或替代全部的所述鞭毛素派生的佐剂的DNA序列的高变域，然后与变形链球菌葡糖基转移酶派生的抗原的DNA序列连接后共表达而成的重组蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：鄢慧民，钟茂华，杨菁毅，包容，孙颖，
申请(专利权)人：鄢慧民，钟茂华，杨菁毅，包容，孙颖，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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