一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种免疫原性组合物，所述组合物由弓形虫erk7重组蛋白和佐剂。本发明专利技术还提供用于弓形虫感染预防的免疫疫苗，所述疫苗的有效成分为权利要求1-4任一所述的免疫原性组合物。本发明专利技术的免疫疫苗能够有效地延长弓形虫GT1急性感染BALB/c鼠的存活时间，本发明专利技术的免疫疫苗对PRU急性感染并无明显效果，但能大幅度降低弓形虫PRU慢性感染中脑包囊数目，取得了良好的免疫效果。

【技术实现步骤摘要】
一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗
本专利技术涉及一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗。
技术介绍
刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）是一种严格胞内寄生性原虫，呈世界性分布，能感染包括人和动物在内的所有温血动物，是典型的人兽共患性寄生虫病病原。全球约有35%的人群感染弓形虫，部分地区感染率更高。弓形虫感染多呈隐性，对免疫功能低下或缺陷病人如器官移植病人、AIDS和恶性肿瘤患者以及孕妇人群危害最大。同时，弓形虫感染家畜，能够造成患病家畜流产、早产、死胎、畸胎等症状，给畜牧业发展带来巨大经济损失。目前仍无治疗弓形虫病的理想药物，因此研制安全有效的抗弓形虫疫苗在弓形虫病的预防和治疗中尤为重要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗，具有良好的免疫效果。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是细胞信号转导途径的重要组分，有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，主要介导DNA损伤修复以及细胞增殖、分化、凋亡、迁移和应激反应等重要生命活动，与炎症和肿瘤的发生发展紧密相关。弓形虫erk7基因编码的ERK7蛋白属MAPK激酶家族，可能参与调控机体细胞的增殖和/或分化功能。弓形虫erk7基因由11个外显子和10个内含子组成，全长6596bp，负责编码692个氨基酸,分子量约74kD。本专利技术将弓形虫erk7基因原核表达所得的ERK7蛋白与弗氏佐剂（Freund'sadjuvant，FA）联合应用，进行抗弓形虫急性和/或慢性感染的免疫效果评估。结果显示，该蛋白疫苗的免疫新方案能够有效地延长弓形虫GT1急性感染BALB/c鼠的存活时间，以及抑制弓形虫PRU慢性感染中脑包囊的产生，取得了较好的免疫保护性效果。本专利技术提供一种一种免疫原性组合物，所述组合物由弓形虫erk7重组蛋白和佐剂。作为优选方案，所述佐剂为弗式完全佐剂和弗氏不完全佐剂。作为另一优选方案，所述疫苗中的蛋白浓度为0.7mg/mL。作为又一优选方案，所述弓形虫erk7重组蛋白与佐剂的体积比值为：1:1。本专利技术还要求保护一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗，所述疫苗的有效成分为权利要求1-4任一所述的免疫原性组合物。本专利技术还要求保护疫苗的制备方法，步骤如下：（1）制备弓形虫erk7重组蛋白；（2）将弓形虫erk7重组蛋白与佐剂混合制剂，得到疫苗。本专利技术还要求保护上述免疫原性组合物或免疫疫苗在制备预防弓形虫感染的药物中的应用。本专利技术还要求保护编码权利要求1所述的弓形虫erk7重组蛋白的核酸。本专利技术还要求保护包含权利要求7所述核酸的表达载体。本专利技术还要求保护包含权利要求8所述的表达载体的宿主细胞。本专利技术的免疫疫苗能够有效地延长弓形虫GT1急性感染BALB/c鼠的存活时间，本专利技术的免疫疫苗对PRU急性感染并无明显效果，但能大幅度降低弓形虫PRU慢性感染中脑包囊数目，取得了良好的免疫效果。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为弓形虫GT1感染BALB/c鼠存活时间线形图；图2为弓形虫PRU慢性感染中脑包囊数目线形图；图3为原核表达载体pET30a质粒图；图4为重组载体pET30a-erk7质粒图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例1（一）构建原核表达载体pET30a-erk71、弓形虫GT1总RNA的提取：从液氮中取出弓形虫GT1虫株，37℃迅速解冻后腹腔接种BALB/c雌鼠若干。连续传代三次后，无菌收集发病的BALB/c鼠腹水，室温9000rpm离心10min。沉淀用于GT1总RNA提取，提取方法参照北京天根生化科技有限公司RNAprepPure动物组织总RNA提取试剂盒的使用说明书进行。2、弓形虫erk7基因的特异性扩增：以弓形虫GT1总RNA为模板，参照PrimeScript®OneStepRT-PCR试剂盒（TaKaRa）使用说明，特异性扩增erk7目的基因，反应体系为：PrimeScript®OneStepEnzymeMix1μL，2×OneStepBuffer12.5μL，上/下游引物（20μM）各0.5μL，总RNA模板1μL，补加RNaseFreedH2O至25.0μL；反应条件为：50℃RT反应30min；95℃RTase失活2min；95℃预变性5min；95℃变性45s，56.5℃退火30s，72℃延伸2min，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。上游引物：5′-GGAATTCCATATGAAACACCATCATCATCATCATCAGATGAGTGACGAGGTCGACAAAC-3′，下游引物：5′-CCGGAATTCTTATCAGCTGTTGTATGTCTTGGAC-3′。其中，单划线、双划线和虚线标注处分别为NdeI位点、6×His标签和EcoRI位点；3、目的基因的连接、转化与测序：RT-PCR产物经回收纯化后与pMD18-TVector（TaKaRa）4℃条件下连接过夜，产物命名为pMD18-erk7，并将其转入DH5α感受态细胞。阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果显示，扩增的erk7的核苷酸序列参见序列表SEQIDNo.1，其编码的氨基酸序列参见序列表SEQIDNo.2。4、小量提取质粒：参照北京天根生化科技有限公司TIANprepMiniPlasmidKit的使用说明进行。5、目的片段的回收与原核表达载体的构建：将pET30a和pMD18-erk7质粒分别双酶切（NdeI/EcoRI）后，进行目的片段的回收纯化。经T4DNALigase（TaKaRa），将erk7基因定向亚克隆至pET30a原核表达载体中。连接产物转入原核表达菌BL21的感受态细胞中，阳性菌株命名为pET30a-erk7。其核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo.4。（二）ERK7原核表达蛋白的纯化与定量1、原核表达ERK7蛋白：将阳性表达菌pET30a-erk70.4mL接种于400mLLB培养基（Kan+抗性）中，培养过夜后常规诱导ERK7蛋白的表达。2、ERK7蛋白的预处理：4℃条件下，9000rpm离心10min，弃上清。向所得菌体沉淀中加入20mL无菌PBS溶液，漩涡震荡混匀。-80℃与37℃反复冻融三次后进行超声破碎（超声4s，停3s，共超声破碎7min）。超声结束后，4℃10000rpm离心1min，弃上清，沉淀用40mL8M尿素溶解。3、ERK7蛋白的纯化：蛋白纯化参照Novagen公司Ni-NTAHis·Bind®Resin试剂盒使用说明进行。4、ERK7蛋白的透析：使用21MM透析袋（MW：12000-14000）常规透析，透析液为无菌PBS溶液。5、ERK7蛋白的定量：透析产物的浓度用分光光度计在280nm波长处测得，浓度为1.238mg/mL。（三）免疫效果的评估1、BALB/c实验鼠的分组：4-6周龄BALB/c雌鼠购买自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心，并将其随机分为3组（I：BlankControl；II：PBS+FA；III：ERK7+FA），每组16只。2、免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫原性组合物，其特征在于：所述组合物由弓形虫erk7重组蛋白和佐剂。

【技术特征摘要】
1.一种免疫原性组合物，其特征在于：所述组合物由弓形虫erk7重组蛋白和佐剂组成；所述佐剂为弗式完全佐剂或弗氏不完全佐剂；所述弓形虫erk7重组蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2所示。2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于：所述弓形虫erk7重组蛋白与佐剂的体积比值为：1:1。3.一种用于弓形虫感染预防的免疫疫苗，其特征在于：所述疫苗的有效成分为权利要求1或2所述的免疫原性组合物。4.权利要求3所述的疫苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：李中原，赵禹，朱兴全，徐民俊，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62