【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒p30蛋白抗体的竞争elisa试剂盒。
技术介绍
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)引起的，它是一种古老的、猪的一种疾病。目前，非洲猪瘟的防控，主要采取持续监测与区域化防控管理来防止病毒的入侵。
2、血清学抗体检测是诊断asf的重要手段。在流行国家或无非洲猪瘟国家，elisa通常用于诊断asfv的感染和评估疾病的流行。欧盟已经批准了三种抗体检测elisa试剂盒，包括ingenasa、idvet和svanovir，平均准确率约为80％。目前，许多elisa的血清学检测都是基于结构蛋白，其中p30是最常用的诊断抗原。p30蛋白由cp204l基因编码，其分子质量大小约为23.6kda。p30蛋白在asfv感染细胞2～4h就可以被检出，是一个早期表达蛋白。因此，p30蛋白可以作为诊断asfv早期感染的检测靶标。
3、asfv感染机体后，可在7～10d内产生抗体。病毒侵入机体后最早出现的是免疫球蛋白igm抗体，该抗体大约需要5～7d产生，然后在10～15d出现igg抗体。
技术实现思路
1、本专利技术筛选出一株特异性针对asfv p30蛋白的单克隆抗体，并基于此研发出检测asfv p30蛋白抗体的竞争elisa试剂盒，该试剂盒较间接、阻断elisa用时短，具有很好的特异性和敏感性；另外，该试剂盒最早能检测出asfv感
2、本专利技术的第一个目的是提供一株特异性针对asfv p30蛋白的单克隆抗体。
3、本专利技术的第二个目的是提供一种asfv p30蛋白抗体的竞争elisa检测试剂盒，该试剂盒操作简便、用时短、特异性好、敏感性高，可用于asfv感染的早期检测。
4、本专利技术的第三个目的是提供一种使用以上所述的试剂盒在制备检测猪血清asfv抗体试剂中的应用。
5、为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案：
6、本专利技术利用原核表达系统获得具有免疫源性及反应性的可溶性asfv p30蛋白，并以此为免疫源免疫小鼠，利用细胞融合和亚克隆筛选技术获得一株特异性针对asfv p30蛋白的单克隆抗体，将其命名为2a6。本专利技术利用套式pcr扩增技术获得了抗体2a6的可变区基因序列，后续可利用基因工程或蛋白质工程方法获得。
7、本专利技术又基于特异性针对asfv p30蛋白的单克隆抗体制备出的检测asfv p30蛋白抗体的竞争elisa试剂盒。该试剂盒包括：包被有asfv p30蛋白的酶标板、hrp标记的asfvp30蛋白单克隆抗体(即抗体2a6)、阳性对照血清及阴性对照血清。
8、其中，asfv p30蛋白的制备方法为：以asfv p30蛋白(genbank登录号：mk128995.1)为参考，设计特异性引物，通过pcr扩增获得p30基因，将其与原核表达载体pcoldi载体连接，构建重组质粒pcoldi-p30，转化大肠杆菌bl21(de3)，通过iptg诱导表达获得重组p30蛋白，然后使用镍柱纯化获得纯化的重组p30蛋白。所述的asfv p30蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示，编码asfv p30蛋白的dna序列如seq id no:2所示。
9、seq id no:1：
10、mkmevifktdlrsssqvvfhagslynwfsveiinsgrivttaiktllstvkydivksariyagqgytehqaqeewnmilhvlfeeetessassenihekndnetnectssfetlfeqepssevpkdsklymlaqktvqhieqygkapdfnkvirahnfiqtiygtplkeeekevvrlmvikllkkk*；
11、seq id no:2：
12、atgaaaatggaggtcatcttcaaaacggatttaagatcatcttcacaagttgtgtttcatgcgggtagcctgtataattggttttctgttgagattatcaatagcggtagaattgttacgaccgctataaaaacattgcttagtactgttaagtatgatattgtgaaatctgctcgtatatatgcagggcaagggtatactgaacatcaggctcaagaagaatggaatatgattctgcatgtgctgtttgaagaggagacggaatcctcagcatcttcggagaacattcatgaaaaaaatgataatgaaaccaatgaatgcacatcctcctttgaaacgttgtttgagcaagagccctcatcggaggtacctaaagactccaagctgtatatgcttgcacaaaagactgtgcaacatattgaacaatatggaaaggcacctgattttaacaaggttattagagcacataattttattcaaaccatttatggaacccctctaaaggaagaagaaaaagaggtggtaagactcatggttattaaacttttaaaaaaaaaataa。
13、更进一步的，所述asfv p30蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
14、将纯化的重组p30蛋白作为免疫源，按30μg/只的量免疫balb/c小鼠。首次免疫，将重组p30蛋白与弗氏完全佐剂等体积混匀后进行乳化，采用多点背部及腹部皮下注射。每隔2周进行加强免疫，共免疫四次。加强免疫是将重组p30蛋白和弗氏不完全佐剂等体积混匀进行乳化，免疫方法同首次免疫。第四次免疫后，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，将细胞上清进行间接elisa和间接免疫荧光试验(ifa)验证，筛选得到阳性克隆，经过三次亚克隆后，杂交瘤细胞注射小鼠进行腹水的制备，进而得到asfvp30蛋白单克隆抗体。
15、所述asfv p30蛋白单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如seq id no:3所示；所述asfv p30蛋白单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:4所示。其中，单克隆抗体重链及轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如下：
16、 —— cdr1 cdr2 cdr3 重链vh gfsltsyg iwsggstd a本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列为GFSLTSYG的CDR1、氨基酸序列为IWSGGSTD的CDR2、氨基酸序列为AFYAMDY的CDR3；轻链可变区包括氨基酸序列为ESVDNYGISF的CDR1、氨基酸序列为AAS的CDR2、氨基酸序列为QQSKEVPWT的CDR3。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，其特征在于，单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
3.编码权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
5.包含权利要求3所述的基因的重组表达载体。
6.包含权利要求5所述的重组表达载体的宿主细胞。
7.权利要求1或2所述单克隆抗体、权利要求3或4所述的基因、权利要求5所述的重组表达载体、权利要
8.检测非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体的竞争ELISA试剂盒，其特征在于，包括：包被有非洲猪瘟病毒p30蛋白的酶标板、HRP标记的权利要求1或2所述的单克隆抗体、阳性对照血清及阴性对照血清。
9.根据权利要求8所述的竞争ELISA试剂盒，其特征在于，还包括包被液、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、洗涤液、显色液以及终止液。
10.根据权利要求8所述的竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被液为0.05M的碳酸盐缓冲液；
...【技术特征摘要】
1.非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列为gfsltsyg的cdr1、氨基酸序列为iwsggstd的cdr2、氨基酸序列为afyamdy的cdr3；轻链可变区包括氨基酸序列为esvdnygisf的cdr1、氨基酸序列为aas的cdr2、氨基酸序列为qqskevpwt的cdr3。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，其特征在于，单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如seq id no:3、seq id no:4所示。
3.编码权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的基因序列分别如seq id no:5、seq id no:6...
【专利技术属性】
技术研发人员：王琦，曹丽艳，郑海学，孔祥雨，万颖，张宇，袁聪，段月月，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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