一种基因点突变修复的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效精确的基因点突变修复的基因编辑方法，利用核酸酶与不同长度sgRNA结合时对基因组DNA的定点切割能力的不同，辅以靶向性转录调控因子，显著提高同源重组反应效率，可准确、高效地进行基因突变的准确修复或将外源基因导入目的基因组中。本发明专利技术还公开了一种基因编辑的组合物、一种RNA适配体序列与ssgRNA的偶联分子，以及用于基因编辑的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学基因编辑领域。具体而言，本专利技术用于通过基因编辑方法在哺乳动物细胞中对基因突变进行定点修复与外源基因敲入。
技术介绍
目前基因组定点编辑/修饰的基本原理是利用在靶位点区自发或诱发的DNA双链缺口(double-strainbreaks,DSBs)，DSBs将激活细胞内的DNA修复机制来进行基因组的改造，比如非同源区的末端连接(Non-homologousendjoint，NHEJ)或是同源重组(Homologousrecombination，HR)(附图1)。在哺乳动物细胞内，DSB自发产生的概率约低于1/104，如果通过基因工程方法采用spCas9和SaCas9等核酸酶诱发DSBs，效率可提高至10％以上，且具有位点特异性，因此方便了下一步对内源基因靶位点进行的基因修复过程顺利进行。DSBs激活细胞内的DNA修复通路后，会有两种不同的修复机制竞争性的参与DSBs的修复，一种是非同源区的末端连接NHEJ，一种是同源重组HR。要实现基因组靶位点的精准编辑，需要依赖胞内的同源重组修复机制。因此直接提高DSBs修复过程中同源重组发生的频率或抑制非同源区的末端连接(NHEJ)都有助于提高基因组定点编辑/修饰的效率。非同源区的末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)的发生都有多种蛋白参与其中，其中LIG4蛋白是NHEJ的重要因子，Rad51、Rad52和Brca1则是同源重组修复过程的重要参与蛋白。因此如果能够抑制LIG4蛋白的表达和/或促进Rad51、Rad52和Brca1的表达将有助于提高基因组定点编辑/修饰的效率。Cas9等核酸酶对基因组的切割需要sgRNA的引导，当sgRNA的长度为20-21bp时，Cas9可以识别并切割靶位点，从而在靶位点处留下DSBs缺口；当sgRNA长度为14-15bp时，Cas9可以识别并结合靶位点，但却无法切割该位点。这一特性可被加以改造用于基因转录的抑制/激活。通过设计不同长度的sgRNA，我们还可以同时实现靶基因的激活/抑制和靶位点的切割与同源修复。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于同源重组的基因编辑方法，包括采用核酸酶对目标基因进行切割，其特征在于：所述方法中还包括ssgRNA和靶向性转录调控因子，所述ssgRNA能够引导核酸酶靶向基因编辑相关蛋白的编码核酸但不会发生切割，所述靶向性转录调控因子能够调控基因编辑相关蛋白的转录。其中，所述的核酸酶对目标基因进行同源重组包括采用sgRNA，所述sgRNA能够引导核酸酶靶向目标基因进行切割；优选所述sgRNA包括3'端的保守间隔相邻基序，优选所述的基序为NGG；优选所述sgRNA为18-23bp，优选20bp。在本专利技术的一些具体实施例中，所述的核酸酶选自Cas9和CPF1，所述Cas9优选选自SaCas9、SpCas9。在本专利技术的一些具体实施例中，所述方法中还包括同源互补修复模板，优选在同源重组的整合位点删除终止密码子。在本专利技术的一些具体实施例中，所述的ssgRNA包括3'端的保守间隔相邻基序，优选所述的基序为NGG；优选所述的ssgRNA为14-16bp，更优选为14bp、15bp或16bp。本专利技术利用DNA序列特异性的染色体双链DSBs生成技术，通过改造sgRNA并设计不同长度的sgRNA，辅以靶向性转录调控因子来实现高效、精确的基因组定点改造。在本专利技术的一些具体实施例中，所述的靶向性转录调控因子选自靶向性转录激活因子或靶向性转录抑制因子的至少一种，优选所述靶向性转录激活因子选自VP64，优选所述靶向性转录抑制因子选自KRAB。本专利技术利用Cas9与不同长度sgRNA结合时活性的不同，实现对不同靶位点的差异调控，通过激活同源重组酶的表达/抑制NHEJ修复关键酶的表达，提高同源重组效率从而实现内源性基因突变的高效精准修复。在本专利技术的一些具体实施例中，所述的基因编辑相关蛋白选自非同源区末端连接相关蛋白和同源重组相关蛋白的至少一种，优选所述非同源区末端连接相关蛋白选自LIG4，优选所述同源重组相关蛋白选自Rad51、Rad52和Brca1或其组合。本专利技术利用序列特异性的核酸酶(sequence-specificendonuclease)在靶位点处或附近制造一个DSBs；在此基础上，本专利技术利用长度不同的sgRNA和靶向性转录激活/抑制因子，激活同源重组相关蛋白表达，抑制非同源性的末端连接相关蛋白表达，实现靶位点处高效特异性的同源重组修复(见附图2，原理图)。在本专利技术的一些具体实施例中，所述方法中的核酸酶与靶向性转录调控因子形成融合蛋白，优选所述融合蛋白包含柔性连接子。在本专利技术的一些具体实施例中，所述的ssgRNA还偶联了RNA适配体序列，所述RNA适配体序列能够特异性的与关联蛋白结合，所述靶向性转录调控因子与所述的关联蛋白形成融合蛋白。在本专利技术的一些具体实施例中，所述方法中的核酸酶与第一靶向性转录调控因子形成融合蛋白，优选所述融合蛋白包含柔性连接子，所述的ssgRNA还偶联了RNA适配体序列，所述RNA适配体序列能够特异性的与关联蛋白结合，第二靶向性转录调控因子与所述的关联蛋白形成融合蛋白。本专利技术中，引入转录调控因子的策略可以但不限于，策略1：核酸酶与靶向性转录调控因子形成融合蛋白；或策略2：靶向性转录调控因子与所述关联蛋白(例如MS2结合蛋白或PCP结合蛋白)形成融合蛋白，再与偶联了RNA适配体序列(例如MS2或PP7)的ssgRNA结合；或策略3：在一个方法中同时存在上述两种策略。在同源重组的基因编辑方法中，引入转录调控因子的策略还包括本领域技术人员根据现有技术或常规技术将转录调控因子(例如VP64或KRAB)引入所述同源重组相关蛋白(例如选自Rad51、Rad52和Brca1或其组合)启动子区的其他可能策略，例如通过融合蛋白的表达，转录调控因子表达在核酸酶-ssgRNA复合体上，只要所述转录调控因子具有能够激活或抑制所述同源重组相关蛋白的转录的作用。另外，申请人在实验中发现，策略1和3与策略2的结果相似，这些基因编辑方法均可以大幅度提高了哺乳细胞中同源重组发生的效率。其中，策略3相比策略1和2可以更高效激活或抑制靶基因的转录。根据此原理，本领域技术人员设计靶向所述同源重组相关蛋白(例如选自Rad51、Rad52和Brca1或其组合)启动子区的ssgRNA并将转录调控因子(例如)引入所述同源重组相关蛋白(例如选自Rad51、Rad52和Brca1或其组合)启动子区的任何可能策略也属于本专利技术的
技术实现思路
。在本专利技术的一些具体实施例中，所述RNA适配体为发夹结构；优选所述发夹结构选自MS2或PP7，所述关联蛋白选自MS2结合蛋白或PCP结合蛋白。例如本专利技术利用改造的sgRNA(携带有MS2/PP7等特殊的发夹结构，可被MS2结合蛋白/PCP蛋白等特异性识别)，辅以靶向性转录激活/抑制因子(MS2/PCP-VP64/KRAB)，可以激活/抑制特定基因的转录。另一方面，本专利技术还提供了一种用于基因编辑的组合物，包括ssgRNA和靶向性转录调控因子，所述ssgRNA能够引导核酸酶靶向基因编辑相关蛋白的编码核酸但不会发生切割，所述靶向性转录调控因子能够调控基因编辑相关蛋白的转录。其中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于同源重组的基因编辑方法，包括采用核酸酶对目标基因进行切割，其特征在于：所述方法中还包括ssgRNA和靶向性转录调控因子，所述ssgRNA能够引导核酸酶靶向基因编辑相关蛋白的编码核酸但不会发生切割，所述靶向性转录调控因子能够调控基因编辑相关蛋白的转录。

【技术特征摘要】
1.一种基于同源重组的基因编辑方法，包括采用核酸酶对目标基因进行切割，其特征在于：所述方法中还包括ssgRNA和靶向性转录调控因子，所述ssgRNA能够引导核酸酶靶向基因编辑相关蛋白的编码核酸但不会发生切割，所述靶向性转录调控因子能够调控基因编辑相关蛋白的转录。2.如权利要求1所述的方法，所述的核酸酶对目标基因进行同源重组包括采用sgRNA，所述sgRNA能够引导核酸酶靶向目标基因进行切割；优选所述sgRNA包括3'端的保守间隔相邻基序，优选所述的基序为NGG；优选所述sgRNA为18-23bp，优选20bp。3.如权利要求1或2所述的方法，所述的核酸酶选自Cas9和CPF1，所述Cas9优选选自SaCas9、SpCas9。4.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述方法中还包括同源互补修复模板，优选在同源重组的整合位点删除终止密码子。5.如权利要求1-4任一项所述的方法，所述的ssgRNA包括3'端的保守间隔相邻基序，优选所述的基序为NGG；优选所述的ssgRNA为14-16bp，更优选为14bp、15bp或16bp。6.如权利要求1-5任一项所述的方法，所述的靶向性转录调控因子选自靶向性转录激活因子或靶向性转录抑制因子的至少一种，优选所述靶向性转录激活因子选自VP64，优选所述靶向性转录抑制因子选自KRAB。7.如权利要求1-6任一项所述的方法，所述的基因编辑相关蛋白选自非同源区末端连接相关蛋白和同源重组相关蛋白的至少一种，优选所述非同源区末端连接相关蛋白选自LIG4，优选所述同源重组相关蛋白选自Rad51、Rad52和Brca1或其组合。8.如权利要求1-7任一项所述的方法，所述方法中的核酸酶与靶向性转录调控因子形成融合蛋白，优选所述融合蛋白包含柔性连接子。9.如权利要求1-7任一项所述的方法，所述的ssgRNA还偶联了RNA适配体序列，所述RNA适配体序列能够特异性的与关联蛋白结合，所述靶向性转录调控因子与所述的关联蛋白形成融合蛋白。10.如权利要求1-7任一项所述的方法，所述方法中的核酸酶与第一靶向性转录调控因子形成融合蛋白，优选所述融合蛋白包含柔性连接子，所述的ssgRNA还偶联了RNA适配体序列，所述RNA适配体序列能够特异性的与关联蛋白结合，第二靶向性转录调控因子与所述的关联蛋白形成融合蛋白。11.如权利要求9或10任一项所述的方法，所述RNA适配体为发夹结构；优选所述发夹结构选自MS2或PP7，所述关联蛋白选自MS2结合蛋白或PCP结合蛋白。12.一种用于基因编辑的组合物，包括ssgRNA和靶向性转录调控因子，所述ssgRNA能够引导核酸酶靶向基因编辑相关蛋白的编码核酸但不会发生切割，所述靶向性转录调控因子能够调控基因编辑相关蛋白的转录...

【专利技术属性】
技术研发人员：程田林，仇子龙，
申请(专利权)人：苏州兰希亚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32