本发明专利技术实施例提供了一种ALL预后相关基因突变检测方法、引物及试剂盒。本发明专利技术应用PCR和测序两项技术，主要通过特异性引物扩增基因组DNA中的CREBBP基因的特定外显子区段，通过测序反应对扩增所得到的目的片段进行测序，再通过与标准基因序列进行比较，检测是否存在突变；其检测过程快速灵敏，操作简单且准确性高，检测结果明确清晰；检测特异性强，采用目前最准确的基因突变检测方法，目的性强；检测标本采血量少，利于检测对象自身，使用的实验器材较少，节约成本。本发明专利技术旨在获得可供急性淋巴细胞白血病用药指导及预后评估的分析数据，可在医学检测领域发挥重大的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学及分子生物学
，具体涉及一种ALL(Acute Lymphoblastic Leukemia，急性淋巴细胞白血病)预后相关基因突变检测方法。本专利技术还提供了该检测方法所使用的引物以及包含该引物的试剂盒。
技术介绍
ALL是一种起源于B系或T系淋巴祖细胞的肿瘤性疾病，原始细胞在骨髓异常增生和聚集并抑制正常造血，导致贫血，血小板减少和中性粒细胞减少；原始细胞也可侵及髓外组织，如脑膜、性腺，胸腺、肝、脾，或淋巴结等，引起相应病变。2008年WHO对ALL的诊断标准是：细胞形态、免疫表型，骨髓原始及幼稚淋巴细胞≥20％，分类为：①前体B细胞急性淋巴细胞白血病(细胞遗传学亚型)：t(9；22)(q34；q11)，(BCR/ABL)；t(4；11q23)，(MLL重排)；t(1；19)(q23；p13)，(E2A/PBX1)；t(12；21)(p12；q22)，(ETV/CBFα)；②前体T细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)；③Burkitt细胞白血病。虽然ALL治愈率提高到了90％，但该病一旦复发，其结果常常是致命的。ALL的复发率高，成人相对于儿童预后不良，应依据疾病危险分组进行个体化治疗，防治感染和出血，以减少复发，延长无病生存时间，因此对ALL的复发及用药指导非常重要。CREBBP基因编码转录共激活因子乙酰转移酶CREB结合蛋白，在正常血细胞发育中起着重要作用，帮助开启和关闭其他基因，St.Jude儿童研究医院的研究人员称，该基因是复发危险的潜在指示器，因为复发患者的CREBBP基因突变频率高，而且诊断时就存在的那些变化或复发时白血病细胞亚群所出现的变化从一开始就持续存在着。研究人员还发现，基因的重要调节区会发生变化，并且这些变化会影响细胞功能，比如影响癌症细胞对类固醇类药物的反应，这点在癌症治疗中具有重要意义。综上所述，CREBBP基因有助于癌症病毒对类固醇类药物治疗产生抑制作用，从而助长ALL的复发。鉴于CREBBP基因在ALL患者及正常组织中的表达特点，其基因突变情况可能为ALL复发及用药指导提供重要的分析依据，通过分析CREBBP基因相关突变进行ALL预后评估是具有前景的技术研究方向。因此，如何快速全面的获得检测对象ALL预后CREBBP基因的突变数据，成为当前需要解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术针对当前ALL预后评估的检测技术存在的准确率和便捷性不足的问题，提供了一种新的ALL预后相关基因突变检测方法及相应的引物和试剂盒，综合应用PCR扩增和基因测序技术，可准确快速的检测出检测对象ALL预后相关的CREBBP基因的突变情况，为ALL预后评估提供分析依据。本专利技术实施例一种ALL预后相关基因突变检测方法，包括步骤如下：S1.提取基因组DNA检测样本：采集血液，提取其中的基因组DNA作为检测样本；S2.进行PCR扩增：使用特异性引物对所述检测样本中所述包含热点突变的CREBBP外显子(Expressed Region,Exon)区段的DNA分别进行PCR扩增，回收扩增产物；S3.扩增产物测序：对S2中获得的所述扩增产物进行测序，得到测序结果；S4.基因突变比对：将所述测序结果与数据库中公开的对应基因序列进行比对，获取基因突变检测结果；其中，所述包含热点突变的CREBBP基因外显子包括：第25号、第26号、第27号和第28号外显子。优选的，与所述包含热点突变的CREBBP基因外显子区段对应的特异性引物在序列表中分别为：CREBBP基因外显子：第25号 上游引物：SEQ ID NO.11下游引物：SEQ ID NO.12；第26号 上游引物：SEQ ID NO.13下游引物：SEQ ID NO.14；第27号 上游引物：SEQ ID NO.15下游引物：SEQ ID NO.16；第28号 上游引物：SEQ ID NO.17下游引物：SEQ ID NO.18。优选的，所述包含热点突变的CREBBP基因外显子还包括：第4号、第6号、第10号、第14号、第16号、第31a号、第31b号、第31c号和第31d号外显子。进一步优选的，与所述包含热点突变的CREBBP基因外显子区段对应的特异性引物在序列表中分别为：CREBBP基因外显子：第4号 上游引物：SEQ ID NO.1下游引物：SEQ ID NO.2；第6号 上游引物：SEQ ID NO.3下游引物：SEQ ID NO.4；第10号 上游引物：SEQ ID NO.5下游引物：SEQ ID NO.6；第14号 上游引物：SEQ ID NO.7下游引物：SEQ ID NO.8；第16号 上游引物：SEQ ID NO.9下游引物：SEQ ID NO.10；第25号 上游引物：SEQ ID NO.11下游引物：SEQ ID NO.12；第26号 上游引物：SEQ ID NO.13下游引物：SEQ ID NO.14；第27号 上游引物：SEQ ID NO.15下游引物：SEQ ID NO.16；第28号 上游引物：SEQ ID NO.17下游引物：SEQ ID NO.18；第31a号 上游引物：SEQ ID NO.19下游引物：SEQ ID NO.20；第31b号 上游引物：SEQ ID NO.21下游引物：SEQ ID NO.22；第31c号 上游引物：SEQ ID NO.23下游引物：SEQ ID NO.24；第31d号 上游引物：SEQ ID NO.25下游引物：SEQ ID NO.26。对步骤S1优选的，采集浓度为50～100ng/μL的DNA溶液50μL，使用所述特异性引物配制引物浓度为5pmol/μL的引物使用液用于PCR扩增。优选的，执行所述步骤S3前对所述扩增产物进行电泳检测。对步骤S3优选的，使用3500XL测序仪对所述扩增产物进行上机测序；对步骤S3优选的，使用Mutation Surveyor软件和VECTOR NTI软件将所述测序结果与NCBI数据库中序列进行比对分析，寻找发生突变的基因位点，获得所述基因突变检测结果。本专利技术实施例还提供了一种用于前述ALL预后相关基因突变检测方法的引物，包括多对特异性引物，每对所述特异性引物均包括一上游引物和一下游引物，每对所述特异性引物均对应一个所述包含热点突变的CREBBP基因外显子区段，所述特异性引物在序列表中的序列分别为：CREBBP基因外显子：第25号 上游引物：SEQ ID NO.11下游引物：SEQ ID NO.12；第26号 上游引物：SEQ ID NO.13下游引物：SEQ ID NO.14；第27号 上游引物：SEQ ID NO.15下游引物：SEQ ID NO.16；第28号 上游引物：SEQ ID NO.17下游引物：SEQ ID NO.18。优选的，所述引物进一步包括的特异性引物在序列表中的序列分别为：CREBBP基因外显子：第4号 上游引物：SEQ ID NO.1下游引物：SEQ ID NO.2；第6号 上游引物：SEQ ID NO.3下游引物：SEQ ID NO.4；第10号 上游引物：SEQ ID NO.5下游引物：SEQ ID NO.6；第14号 上游引物：SEQ ID NO.7下游引物：SEQ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ALL预后相关基因突变检测方法，其特征在于，包括步骤如下：S1.提取基因组DNA检测样本：采集血液，提取其中的基因组DNA作为检测样本；S2.进行PCR扩增：使用特异性引物对所述检测样本中包含热点突变的CREBBP基因外显子区段的DNA分别进行PCR扩增，回收扩增产物；S3.扩增产物测序：对S2中获得的所述扩增产物进行测序，得到测序结果；S4.基因突变比对：将所述测序结果与数据库中公开的对应基因序列进行比对，获取基因突变检测结果；其中，所述包含热点突变的CREBBP基因外显子包括：第25号、第26号、第27号和第28号外显子。
【技术特征摘要】
1.一种ALL预后相关基因突变检测方法，其特征在于，包括步骤如下：S1.提取基因组DNA检测样本：采集血液，提取其中的基因组DNA作为检测样本；S2.进行PCR扩增：使用特异性引物对所述检测样本中包含热点突变的CREBBP基因外显子区段的DNA分别进行PCR扩增，回收扩增产物；S3.扩增产物测序：对S2中获得的所述扩增产物进行测序，得到测序结果；S4.基因突变比对：将所述测序结果与数据库中公开的对应基因序列进行比对，获取基因突变检测结果；其中，所述包含热点突变的CREBBP基因外显子包括：第25号、第26号、第27号和第28号外显子。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：与所述包含热点突变的CREBBP基因外显子区段对应的特异性引物在序列表中分别为：CREBBP基因外显子：3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述包含热点突变的CREBBP基因外显子还包括：第4号、第6号、第10号、第14号、第16号、第31a号、第31b号、第31c号和第31d号外显子。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：与所述包含热点突变的CREBBP基因外显子区段对应的特异性引物在序列表中分别为：CREBBP基因外显子：...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈欣，傅廷娇，张娟，李悠南，程宇，王绪华，梁超，陈忠，黄士昂，
申请(专利权)人：北京海思特临床检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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