一种检测JAK2基因突变的引物与方法技术

本发明专利技术提供一种检测JAK2基因突变的引物，包括针对JAK2基因外显子12的上游引物和下游引物，以及针对JAK2基因外显子13的上游引物和下游引物。本发明专利技术属于生物检测技术领域，本发明专利技术提供的引物可以实现JAK2基因外显子12和外显子13突变的特异性检测，引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】
一种检测JAK2基因突变的引物与方法
本专利技术属于生物检测
，尤其涉及一种检测JAK2基因突变的引物与方法。
技术介绍
JAK/STAT通路是造血生长因子广泛应用的信号传导通路，该通路的激活与多种肿瘤相关。JAK2基因编码Janus酪氨酸激酶2(Januskinase2，JAK2)，参与造血细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等多种反应。骨髓增殖性疾病(Myeloproliferativeneoplasms，MPN)是一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞不断克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称，其中以真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、骨髓纤维化(MF)最常见。MPN发病机制不明，但大部分患者存在JAK2基因突变的情况，其中，JAK2的14号外显子V617F突变是最为常见的突变，见于约95%的PV、约50%的ET和MF患者中。2007年Scott等首次报道JAK2V617F阴性的PV患者中存在JAK2基因12外显子的突变，相关研究数据显示，JAK2基因外显子12和13主要影响红系发育，约2%-4%的PV患者JAK2基因外显子12、13发生突变，但未发现JAK2基因外显子12、13突变与ET以及MF等JAK2V617F阴性的其它MPN的相关性。和JAK2V617F单一位点突变不同，JAK2基因外显子12的突变形式多样，涉及所编码蛋白的第536至547位氨基酸，突变类型包括点突变、缺失及插入，JAK2基因外显子13突变形式则主要为点突变(COSMIC)。中国专利申请201110396831.1公开了检测JAK2基因突变的引物和探针，该专利申请将特异性引物与双环探针相结合，通过荧光PCR实现了JAK2基因突变的检测，但存在反应体系复杂，需要多种引物和荧光定量PCR仪的缺点。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种检测JAK2基因突变的引物与方法，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了检测JAK2基因外显子12和外显子13突变的准确检测。本专利技术检测的位点包括JAK2基因外显子12和外显子13。本专利技术提供一种检测JAK2基因突变的引物，包括针对JAK2基因外显子12的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTTTGGAGCAATTCATAC(SEQIDNO.1)和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCCATCTAACACAAGGTTGGCATA(SEQIDNO.2)，以及针对JAK2基因外显子13的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTTTCTGTCTCTTATTACTATTTA(SEQIDNO.3)和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCTCCTCAGAAAAGTCCTTGACACATT(SEQIDNO.4)。优选地，所述引物中，外显子12的上游引物、外显子12的下游引物、外显子13的上游引物和外显子13的下游引物浓度比为1：1：1：1。相应地，本专利技术还提供一种检测JAK2基因突变的方法，包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C）对扩增产物进行凝胶电泳分析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。优选地，所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。优选地，所述步骤B）中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃3min；阶段2：98℃10s；阶段3：63℃30s；阶段4：72℃1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃保温。优选地，所述步骤C）中，采用Sequencher4.1.4软件对检测结果进行分析。此外，本专利技术还提供检测JAK2基因突变的引物在制备检测JAK2基因突变试剂中的用途。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种检测JAK2基因外显子12和外显子13突变的引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本专利技术还提供了一种检测JAK2基因外显子12和外显子13突变的方法，通过使用特异性的引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可以作为JAK2V617F检测阴性的真性红细胞增多症患者的辅助检测方法，进而为其临床用药提供指导。附图说明图1本专利技术提供的JAK2基因外显子12引物的扩增片段。图2本专利技术提供的JAK2基因外显子13引物的扩增片段。图3PCR扩增产物的凝胶电泳图。图4JAK2基因外显子12野生型的部分测序图。图5JAK2基因外显子13野生型的部分测序图。图6JAK2基因外显子12突变型的部分测序图。图7JAK2基因外显子13突变型的部分测序图。图8同一样品不同批次的PCR扩增产物的部分凝胶电泳图。图9同一样品不同孔间的PCR扩增产物的部分凝胶电泳图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步详细说明。实施例一引物专利技术人针对JAK2基因外显子12和外显子13，设计了大量引物，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好的引物。实施例二引物的特异性将本专利技术提供的引物于UCSC中进行Blasting，JAK2基因外显子12引物扩增片段位于chr9:5069859-5070214间，长度为356bp；JAK2基因外显子13引物对扩增片段位于chr9:5072300-5072758，长度为459bp。无其它同源基因，结果如图1至图2所示，与JAK2基因参考序列相符。使用表1中的引物、表2中的PCR扩增体系和表3的PCR扩增条件对检测样品进行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图3所示。结果显示，扩增产物的特异性高，无非特异性扩增条带产生。实施例三JAK2基因外显子12和外显子13突变的检测提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANampBloodDNAKit（购自Tiagen，货号：DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。PCR扩增采用Q5™热启动超保真2XMasterMix（购自NEB公司，货号：M0494L），PCR扩增体系如表2所示，PCR扩增条件如表3所示。外显子12的上游引物、外显子12的下游引物、外显子13的上游引物和外显子13的下游引物浓度比为1：1：1：1，外显子12的上游引物浓度、外显子12的下游引物浓度、外显子13的上游引物浓度和外显子13的下游引物浓度都为10p/mol。对PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，结果如图3所示。结果显示，扩增产物的特异性高，无非特异性扩增条带产生。采用BigDye®Terminatorv3.1（购自Life公司，货号4336919）对检测样品的PCR扩增产物进行Sanger测序，Sanger测序的操作步骤如下：A)DNA测序模板处理，加入ExoSAP-IT酶，在ABI9700PCR仪中，按以下程序进行处理：37℃，15min；80℃，15min；4℃，infinite。B)参考BigDye®Terminatorv3.1CycleSequencingKit操作说明制备测序PCR体系。C)在ABI9700PCR仪中，按以下程序进行处理：96℃，1min→(96℃，10s→50℃，5s→60℃，4min)，25个循环→4℃保温。D)用酒精/EDTA/NaAc法对测序PCR的产物进行纯化。E)室本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测JAK2基因突变的引物，其特征在于：包括针对JAK2基因外显子12的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTTTGGAGCAATTCATAC和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCCATCTAACACAAGGTTGGCATA，以及针对JAK2基因外显子13的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTTTTCTGTCTCTTATTACTATTTA和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCTCCTCAGAAAAGTCCTTGACACATT。

【技术特征摘要】
1.一组检测JAK2基因突变的引物，其特征在于：包括针对JAK2基因外显子12的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTTTGGAGCAATTCATAC和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCCATCTAACACAAGGTTGGCATA，以及针对JAK2基因外显子13的...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁耀铭，于世辉，赵薇薇，燕启江，胡昌明，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44