本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人B‑raf基因突变的微滴PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品，核酸扩增试剂包括用于检测B‑raf基因突变的引物和探针。本申请的试剂盒采用数字PCR技术，对人类的B‑raf基因突变状态进行定量检测，可用于对结直肠癌、肺癌、恶性肿瘤黑色素瘤、甲状腺癌等患者石蜡包埋病理切片组织中或外周血游离DNA中的B‑raf基因的突变状态进行检测，为临床医生选择肿瘤靶向药物治疗和监测提供参考，具有绝对定量、高特异性、准确性和高灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因突变检测领域，具体讲，涉及一种检测人B-raf基因突变的微滴PCR试剂盒。
技术介绍
在肿瘤治疗中，传统化疗主要针对细胞的DNA，这种作用往往缺乏特异性，在杀死肿瘤细胞的同时，也“错杀”了很多正常细胞。靶向治疗和以前的化疗完全不同。肿瘤的发病有多种机制参与，而这些机制往往是肿瘤细胞所特有的。靶向治疗就是针对肿瘤发病机制中某特有的信号传导通路或者某一发病机制，采用单克隆抗体、小分子物质将它打断，从而达到治疗肿瘤的目的，而对正常细胞作用却很轻微。而靶向药物通过与肿瘤细胞的特征性位点结合，干预控制肿瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路；而肿瘤细胞是有多样性的，并非所有肿瘤细胞都具有一样的特征性位点(因人而异)，因此对于某些特定的靶向药物，在使用前检测患者体内是否有符合条件的基因，判断其肿瘤细胞上是否有符合条件的位点，就可以预知该药物是否会奏效，这从临床上节省了金钱和时间。这样的诊断模式被称为“个体化诊断”。对于靶向药物来说，使用前进行“个体化诊断”是保证安全、有效用药的必要步骤。B-raf基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌(v-raf)致癌同源体B1，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。在结直肠癌(CRC)中，B-raf突变率约为15％左右，这些突变主要发生于外显子15上的激活区，其中约92％位于第1799位核苷酸上(T突变为A)，导致其编码的谷氨酸有缬氨酸取代(V600E)。B-raf基因突变在多种恶性肿瘤细胞中都有报道，除了结直肠癌外，B-raf在恶性肿瘤黑色素瘤、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的突变。目前B-raf基因突变状态的检测一般都是用组织，但在临床应用中，组织标本不易获取，例如对于在晚期的患者，老年患者、伴有重要脏器功能障碍的患者、合并大量胸腹腔积液等患者无法耐受组织活检穿刺取样操作，此外，耐药是大多数患者最终难逃的厄运。无论是患者自身耐受性的限制，或是因需二次取材所面临增高的风险和伦理问题，迫切需要寻找方便、快捷、无创的生物分子检测手段。鉴于此，特提出本申请。
技术实现思路
本申请的专利技术目的在于提出一种检测人B-raf基因突变的微滴PCR试剂盒。为了完成本申请的目的，采用的技术方案为：本申请涉及一种检测人B-raf基因突变的微滴PCR试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，其中，所述核酸扩增试剂包括以下组分，如表1所示：表1：其中，所述用于检测B-raf基因突变的引物和探针：含有由SEQ ID NO：1所示的上游引物；由SEQ ID NO：2所示的下游引物；由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的探针。优选的，SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有MGB；SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有MGB。优选的，所述核酸扩增试剂中各成分的含量为：浓度为100μmol/L的引物各0.18μl，浓度为100μmol/L的探针各0.035μl。优选的，所述核酸扩增试剂中还包括以下组分：编号组分组分中的主要成分2ddPCR MIX3dNTPs、KCl、Tris-HCl、MgCl2、DTT、Taq酶。优选的，所述对照品包括：编号组分组分中的主要成分3阴性对照工艺用水4阳性对照质粒和细胞株DNA混合液优选的，所述质粒和细胞株DNA混合液中含有：由SEQ ID NO：5所示的突变质粒DNA以及HT-1080细胞株DNA。优选的，所述试剂盒所适用的样本选自石蜡包埋切片或外周血游离DNA，优选的，所述样本中DNA的浓度小于或等于50ng/μl；更优选的，所述样本中DNA的浓度大于或等于25ng/μl。本申请还涉及一种采用微滴PCR检测人B-raf基因突变的引物和探针，所述引物和探针的序列为：含有由SEQ ID NO：1所示的上游引物、由SEQ ID NO：5、由SEQ ID NO：2所示的下游引物、由SEQ ID NO：3、由SEQ ID NO：4所示的探针；SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有MGB；SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有MGB。本申请的技术方案至少具有以下有益的效果：本申请的试剂盒采用数字PCR技术，对人类的B-raf基因突变(15号外显子的1799位T突变为A的突变位点)状态进行定量检测，可用于对结直肠癌、肺癌、恶性肿瘤黑色素瘤、甲状腺癌等患者石蜡包埋病理切片组织中或外周血游离DNA中的B-raf基因的突变状态进行检测，为临床医生选择肿瘤靶向药物治疗和监测提供参考，具有绝对定量、高特异性、准确性和高灵敏度，主要优势如下：1、高灵敏度、高特异性：检测复杂背景下的靶标序列灵敏度可达0.001％，样本珍贵或者样本核酸存在降解时的最佳选择。在穿刺样本、胸腹水、外周血中即可完成靶标序列的检测。2、所需样本量少：200μl血浆、1ml全血、2-3片白片及纳克级活检组织，即可完成检测。3、分辨率高：能分辨出单个拷贝的差异，因而特别适合用于低丰度的拷贝数的检测。本申请试剂盒能检出在10000拷贝/μl人基因组DNA背景下含0.1％的B-raf基因相关突变。4、可统计突变率：真正意义上的绝对定量，通过统计分析可得出靶点的突变率，从而可实现对治疗效果的动态追踪，并实现对耐药性发生的判定。5、实验数据分析便捷：每个微滴的检测结果以阴性、阳性判读，数据分析自动化。附图说明图1为阳性对照的ddPCR结果图；图2为阴性对照的ddPCR结果图；图3为测试管的的ddPCR结果图；图4为实施例2中的线性拟合图。下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。具体实施方式本申请提出一种采用ddPCR技术的检测试剂盒，该试剂盒所适用的ddPPCR系统包括微滴发生器和微滴分析仪及其相关的耗材。微滴发生器可将待测DNA分区成20000个均匀的纳升级微滴。将微滴转移至96孔PCR板上，使用热循环仪进行PCR扩増DNA，在每个微滴中PCR反应都独立进行。扩增后采用微滴分析仪进行荧光读取，逐个分析样品中的每个微滴。微滴被吸入后，管路将分解乳化的微滴，并使它们依次通过一个双色光学检测系统。有荧光信号的微滴为阳性，没有荧光信号的微滴为阴性，计算阳性和阴性微滴的数量及阳性微滴的比例。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。本申请提出一种检测人B-raf基因突变的微滴PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品，包括以下组分，具体如表4所示：表4：其中，用于检测B-raf基因突变的引物和探针：含有由SEQ ID NO：1所示的上游引物；由SEQ ID NO：2所示的下游引物；由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的探针。优选的，SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有MGB；SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人B‑raf基因突变的微滴PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，其中，所述核酸扩增试剂包括以下组分：其中，所述用于检测B‑raf基因突变的引物和探针：含有由SEQ ID NO：1所示的上游引物；由SEQ ID NO：2所示的下游引物；由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的探针。
【技术特征摘要】
1.一种检测人B-raf基因突变的微滴PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，其中，所述核酸扩增试剂包括以下组分：其中，所述用于检测B-raf基因突变的引物和探针：含有由SEQ ID NO：1所示的上游引物；由SEQ ID NO：2所示的下游引物；由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有MGB；SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有MGB。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中各成分的含量为：浓度为100μmol/L的引物各0.18μl，浓度为100μmol/L的探针各0.035μl。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还包括以下组分：5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：陶慧卿，李云航，谢立群，陈嘉铮，孙彦波，童光铨，徐任，远义平，陆孟超，
申请(专利权)人：上海睿昂生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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