本发明专利技术公开了一种用于检测B‑RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：B引物组、E‑4引物组、B检测探针、E‑4检测探针和内标检测探针；K检测探针和E‑4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E‑2检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团。本发明专利技术以人类B‑RAF基因突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测B‑RAF基因突变，而且检测突变的能力高。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。
技术介绍
B-raf基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌(V-raf)致癌同源体B1，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2150对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从Ras转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。B-raf基因突变能激活ERK信号，诱导细胞增殖，防止细胞凋亡。约70％的恶性黑色素瘤和15％的结肠癌中存在体细胞B-raf基因错义突变。B-raf基因作为raf-MEK-ERK信号转导通路中的重要成员，在肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥重要作用。正常的B-raf蛋白的功能是传递来自细胞膜的信号。B-raf蛋白通常只在需要传递信号时保持活性状态。然而，突变的B-raf则一直保持活性状态，并因此干扰了细胞信号传递链的正常功能，引起细胞的异常。利用B-raf基因在临床上可对肿瘤(包括癌前病变)进行诊断，预后评估和治疗。通过检测基因突变来推测肿瘤所处的阶段和分化的程度，从而对病情和预后进行评估。随着现在医药行业的发展，已开发出针对肿瘤病变的多种阻断细胞信号通路的药物，但是在使用这些药物时需要确保该信号通路的下游信号分子没有发生激活突变，而这往往正是现在医疗行业需面对的问题，急需一种快速、简便、安全、高灵敏、高通量和低成本的B-raf基因突变检测来辅助这些药物的临床运用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。本专利技术的技术方案如下：一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：B引物组、E-4引物组、B检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；B检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，B引物组由正向引物B-M-F和反向引物B-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01和02所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO03和04所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：B引物组B检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述B检测探针为B-P-C，包括如SEQIDNO05所示的序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述E-4检测探针为E-4-P，所述内标检测探针为E-4-I，均包括如SEQIDNO06所示的序列。上述物及探针具体序列如下表所示：进一步优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ。本专利技术的有益效果：1、本专利技术的试剂盒适合于患者在进入个体化靶向治疗疗程之前使用。可为患者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。2、本专利技术以人类B-RAF基因突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测B-RAF基因突变，而且检测突变的能力高。附图说明图1为本专利技术实施例2的多重荧光PCR反应程序图。图2为本专利技术实施例2中多重荧光PCR检测B-RAF基因V600E突变阴性对照样品检测曲线图。图3为本专利技术实施例2中多重荧光PCR检测B-RAF基因V600E突变的样品检测曲线图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：B引物组、E-4引物组、B检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；B检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ，其中，B引物组由正向引物B-M-F和反向引物B-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01和02所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO03和04所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：B引物组B检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环；后30个循环在退火时检测荧光信号。所述B检测探针为B-P-C，包括如SEQIDNO05所示的序列。所述E-4检测探针为E-4-P，所述内标检测探针为E-4-I，均包括如SEQIDNO06所示的序列。上述物及探针具体序列如下表所示：名称序列B-M-FGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAB-M-RCTCAGCAGCATCTCAGGE-4-FGACTCTGAAGATGTACCTATGGTCCTAE-4-RCTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCTGTB-P-CCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGE-4-PTGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAE-4-ITGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGA实施例1本实施例以人类B-RAF基因V600的V600E突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测V600E突变，而且检测突变的能力高达1％。野生型细胞系H460的基因组DNA为野生型模板，以V600E突变质粒为阳性对照模板，以上述用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒进行多重PCR检测，最终以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准(本实施例中的第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为VIC、ROX或HEX，第一和第二荧光猝灭基团均为BHQ)。上述多重荧光PCR检测的扩增反应体系为：序号物料物料浓度用量(μL)11×PCR缓冲液1×102MgCl225mM83dNTPs10mM54B-M-F50mM25B-M-R50mM0.16B-P-C-FAM50mM0.17E-4-F50mM0.18E-4-R50mM0.19内标检测探针50mM0.11本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测B‑RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括：B引物组、E‑4引物组、B检测探针、E‑4检测探针和内标检测探针；B检测探针和E‑4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E‑4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，B引物组由正向引物B‑M‑F和反向引物B‑M‑R组成，依次包括如SEQ ID NO 01和02所示的序列；E‑4引物组由正向引物E‑4‑F和反向引物E‑4‑R组成，依次包括如SEQ ID NO 03和04所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：B引物组B检测探针和/或E‑4检测探针E‑4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl
【技术特征摘要】
1.一种用于检测B-RAF基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括：B引物组、E-4引物组、B检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；B检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，B引物组由正向引物B-M-F和反向引物B-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01和02所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO03和04所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：B引物组B检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈琰，郭飞飞，
申请(专利权)人：厦门飞朔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35
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