一种检测MTHFR基因突变的探针及其应用和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测MTHFR基因突变的探针及其应用和试剂盒，属于基因检测技术领域。该检测MTHFR基因突变的探针，其包括SEQ ID NO.1所示的检测探针，以及SEQ ID NO.2‑3所示的捕获探针中的一种或两种。该探针可针对MTHFR基因的C677T突变位点进行检测，其具有检测灵敏度高、特异性强、假阳性率低等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测MTHFR基因突变的探针及其应用和试剂盒
本专利技术涉及基因检测技术
，具体而言，涉及一种检测MTHFR基因突变的探针及其应用和试剂盒。
技术介绍
MTHFR(5,10-methylenetetrahydrofolatereductase)全称为5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶，是叶酸和同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)代谢的一个关键酶。位于第一号染色体1p36.3位置。MTHFR全长19.3kb，共有外显子12个，mRNA全长7,105bp，编码657个氨基酸残基组成的蛋白，它的主要生化功能是催化5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸。MTHFR基因主要存在两种多态类型，分别为常见的C677Trs1801133、A1298Crs1801131，另外叶酸代谢循环上还有MTRR基因的A66Grs1801394位点。但实际上只有677位点的多态性与疾病及药物代谢的的关系是被公认的，并且被写入《医疗机构临床检验项目目录(2013年版)》中，该目录没有包括其他2个位点的检测，研究认为，以上位点多态性与多种疾病相关。叶酸在细胞功能、分裂和分化中起着重要的作用，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)能够参与叶酸代谢通路，催化5，10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之参与同型半胱氨酸通路，为同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸，进一步形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，对维持细胞正常周期和细胞活性有着重要的作用。如果这两种途径所涉及到的酶发生缺陷或缺失，将导致通路的阻塞，使血液中的同型半胱氨酸的浓度增加，对血管壁产生损伤。同型半胱氨酸向甲硫氨酸的转换就会发生障碍，相继引发出一系列病理变化：(1)同型半胱氨酸堆积，导致甲基化作用的减弱，这就直接影响50多种重要物质的合成；(2)高浓度的同型半胱氨酸能损害血管的内皮细胞，成为重要的心脑血管致病因素；(3)高浓度的同型半胱氨酸作用于敏感的胚胎神经细胞，可造成无脑畸形和脊柱裂等不可逆损害；(4)同型半胱氨酸溶解性小，易于在泌尿系统形成结石。在MTHRF基因多态性与出生缺陷关系的研究中，几乎所有的焦点都集中于神经管缺陷(NTD)，尽管MTHRF基因突变频率在不同国家和民族分布不同，但来自不同地区的大量研究均证实母亲MTHRFC677T突变是生育神经管缺陷患儿的遗传风险因素。一项分别对母亲、胎儿及父亲的MTHRFC677T突变研究表明，母亲677C/T纯合突变使出生神经管缺陷婴儿的风险升高2倍，胎儿677T/T纯合突变使NTD风险升高1.6倍。与MTHRF基因多态性关系密切的另一种出生缺陷是唐氏综合征。资料显示唐氏综合征患者的第3条21号染色体93％是母源性的，因此母亲的基因或代谢异常是发生唐氏综合征的主要风险因素。近年来的许多研究表明母亲MTHRF基因突变可导致MTHRF活性降低，使作为甲基间接工体的5-甲基四氢叶酸生成障碍，从而导致DNA的低甲基化和染色体异常。此外，MTHFR基因C677T位点多态性与非综合征性唇腭裂的发生存在关联。妊娠相关疾病包括流产、早产、胎儿宫内发育迟缓、胎盘早剥、妊娠高血压综合征等。MTHFR基因C677T突变导致MTHFR血酶活力降低，引起血浆同型半胱氨酸浓度增加，妊娠期高同型半胱氨酸血症可导致血液呈高凝状态，增加胎盘血栓形成的危险，引起胎盘栓塞，造成母胎循环不足，从而可导致流产、胎儿生长受限和胎盘早剥；另一方面，高同型半胱氨酸血症可在金属离子介导下自身氧化生成过氧化物及氧自由基，损伤血管内皮细胞的结构和功能并进一步导致患者血管舒缩因子平衡紊乱，从而引发妊高征。另外由于胎盘组织中MTHFR活力缺乏，致使作为甲基间接供体的5-甲基四氢叶酸生成障碍，进一步影响嘌呤、嘧啶和核酸的代谢及DNA甲基化，使得胎儿发育必需的生物成分包括DNA和蛋白质的甲基化不足，也是引起流产或使胎儿生长受限的原因之一。MTHFR基因的C677T纯合突变，导致酶的活性只有野生型的30％；杂合突变，酶的活性是野生型的70％。在中国人群中，野生型基因比例为27％，而杂合突变的比例为44％，纯合突变的比例为29％。对于MTHFR的C677T基因检测，可以及早发现不同个体对叶酸的吸收水平，从而筛查出容易引起叶酸缺乏的高危人群，实现个体化增补叶酸，同时加强产前检查，以降低新生儿出生缺陷风险。目前，用于MTHFR基因分型的方法有以下几种，各有其特点。1.限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(PCR-RFLP)PCR-RFLP为最为经典的SNP分型方法，它先利用PCR扩增跨越多态位点的靶DNA，然后用相应的限制性核酸内切酶切割PCR产物，最后根据酶切产物的电泳条带判断基因型。PCR-RFLP分型法操作简单，所需模板DNA量少，无需使用大型贵重仪器，实验中不涉及危险试剂，安全性高。但该法的一个最大缺点在于，会因为内切酶的活性、酶切时间、酶切体系的不恰当等原因造成假阴性或假阳性而出现基因型的误判。2.等位基因特异性PCR(allelespecificPCR，AS-PCR)AS-PCR的基本原理是根据SNP位点的碱基特点设计2条等位基因特异引物(针对于野生型等位基因的P1、针对突变型等位基因的P2)，它们的3’末端与SNP位点的碱基互补(或相同)，另需一条按常规方法设计的公共用引物P3。用P1、P3作引物，在野生型等位基因中有扩增产物，在突变型等位基因中没有扩增产物，用P2、P3作引物，情况则刚好相反。PCR结束后，用凝胶电泳检测扩增产物的有无，从而确定基因型。AS-PCR方法避免采取酶切方法，步骤更简洁，但是等位基因特异性PCR扩增方法的假阳性率较高，其对实验要求较严格。3.Taqman探针技术Taqman探针技术在普通PCR的基础上增加荧光标记的探针，随着PCR产物的不断增加，荧光的强度不断增强，则可以检测到一个荧光增长曲线。该法的主要不足是采用荧光淬灭及双末端标记技术，其定量检测受酶活性的影响；本底较强，有时无法鉴别高度相关序列；探针标记以及实验仪器成本较高，不便普及应用。4.高分辨率熔解曲线法高分辨率熔解曲线分析技术(highresolutionmelting，HRM)是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种新技术，它在PCR体系中加入饱和双链DNA结合染料，在PCR结束后制作高分辨率熔解曲线，根据熔解曲线的不同来对样品进行分型。该方法因其快速、通量大、使用成本低、结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。但HRM技术对仪器温度的均一性要求非常高，需LightCycleryTM480PCR仪或LightScanner等价格高昂的专用仪器及精密的分析软件。另外，该法要求扩增片段的大小在400bp以下，引物设计受到局限，PCR条件的优化比较复杂。5.直接测序法。测序法是检测SNP的金标准，准确度高。包括直接测序(双脱氧链终止法)、焦磷酸测序及微测序等。测序需要一些特殊的仪器设备，需要专业人员操作，费用高，周期长；对PCR产物的量、纯度及特异性要求高，PCR后操作步骤繁琐。测序法目前在临床检测方面的应用还是有一定的困难，多作为其他分析方法的确认。6.变性高效液相色谱法。该方法的原理基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测MTHFR基因突变的探针，其特征在于，其包括SEQ ID NO.1所示的检测探针，以及SEQ ID NO.2‑3所示的捕获探针中的一种或两种，所述检测探针的5’端或3’端标记有用于结合催化酶的亲和物。

【技术特征摘要】
1.一种检测MTHFR基因突变的探针，其特征在于，其包括SEQIDNO.1所示的检测探针，以及SEQIDNO.2-3所示的捕获探针中的一种或两种，所述检测探针的5’端或3’端标记有用于结合催化酶的亲和物。2.根据权利要求1所述的检测MTHFR基因突变的探针，其特征在于，所述亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素和生物素中的任意一种。3.权利要求1或2所述的检测MTHFR基因突变的探针在制备用于检测MTHFR基因突变的试剂盒中的应用。4.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的检测MTHFR基因突变的探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于将所述探针的所述捕获探针固定至检测孔板的固定物，所述固定物包括导电聚合物和离子化合物；所述导电聚合物为选自吡咯、苯胺和噻吩中的任意一种；所述离子化合物为选自氯化钠和氯化钾中的任意一种。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括所述催化酶，所述催化酶是...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖玮，莫亚勤，林晓燕，张晨光，
申请(专利权)人：北京易活生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11