一种单碱基突变检测方法技术

本发明专利技术涉及一种核酸短暂杂交与磁分离相结合的单碱基突变检测方法，其包括以下步骤：A，根据目标基因设计捕获探针与信号探针；B，将与捕获探针偶联的磁球配置成磁球溶液，加入信号探针和待测样本进行核酸杂交；C，核酸杂交结束后进行磁分离，然后将磁球重悬于低金属离子的溶液中；D，再次进行磁分离，对获得上清液进行检测，判断待检样本中是否存在单碱基突变；其中，所述捕获探针与目标基因的非突变部分完全互补；所述信号探针与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配。该检测方法快速，能用于低丰度突变检测。

【技术实现步骤摘要】
一种单碱基突变检测方法
本专利技术属于基因突变检测领域，具体涉及一种单碱基突变检测方法。
技术介绍
基因突变，特别是单碱基突变检测技术对疾病的早期诊断和用药策略有着重要的意义。在精准医疗的背景下，基因突变检测已成为一项重要的临床检验指标。基因突变检测技术分为测序型技术和非测序型技术。随着二代测序技术(NextGenerationSequencing)的发展，测序的成本大幅下降，使得很多机构都能够为患者提供基因测序服务。但是二代测序技术需要的核酸浓度较高且分析时间长，而且受到测序深度和核酸聚合酶本身属性的限制，难以在临床样品中直接检出低频突变。非测序型技术主要以核酸杂交探针为基础，其分析目标为已知突变基因的确认和含量测定。依赖于杂交探针的非测序型技术可以与纳米技术、微流控技术、荧光显微技术等相结合，形式灵活多样，易于发展成为临场检测方法(pointofcare，POC)。但是传统的杂交型探针在单碱基选择性上表现较差，这是由核酸杂交的热力学障碍导致，即在室温条件下，探针与野生型和单碱基突变型杂交反应的平衡常数接近。目前，人们已经尝试通过势能陷阱、核酸链交换、核酸酶辅助以及非天然碱基等手段提高单碱基选择性。在动态DNA纳米技术的研究领域，一种新型的核酸杂交模式-核酸短暂杂交近来受到关注。这种杂交模式是指双链核酸在其解链温度附近呈现杂交与解链的平衡，在这种状态下，它可以突破核酸稳定杂交的热力学瓶颈，对单碱基变化非常敏感，在超分辨成像和生化分析领域有较好的应用前景。在室温条件下，一般杂交的双链长度为9-12个碱基。在这种情况下，完全匹配的核酸双链与单碱基错配的核酸双链存在较大的杂交动力学差异，单碱基错配双链的解链动力学常数比完全匹配双链的高20-100倍。利用核酸短暂杂交发展了一种灵敏的单分子miRNA计数方法，在非信号放大的条件下，实现多种miRNA标志物的高灵敏检测。核酸短暂杂交为杂交型核酸探针的发展打开了一扇新的大门，在超高灵敏度基因突变检测方面有着巨大的应用潜力。生物磁珠具有生物相容性好、提供简便的分离平台、成本低廉等特点，一直以来受到生物化学研究工作者的青睐，在生物分子分离富集、生化检测等领域得到了广泛的应用。通过对磁珠进行特异性的修饰，可以选择性的捕获溶液中的目标分子。例如在磁珠上修饰抗体，可以用于富集目标蛋白；在磁珠上修饰核酸适配体，可以富集肿瘤细胞以及小分子目标物。因此，利用磁珠的分离功能和核酸短暂杂交的特点，开发高灵敏度的基因突变检测方法具有较高的可行性。综上所述，高灵敏度基因突变检测方法的开发对于临床诊断研究和基础研究都有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种单碱基突变检测方法，该方法可以快速准确地对单碱基突变基因序列进行检测，对突变序列具有高度的选择性，并且能用于低丰度突变的检测。为此，本专利技术提供了一种核酸短暂杂交与磁分离相结合的单碱基突变检测方法，其包括以下步骤：A，根据目标基因设计捕获探针与信号探针；B，将与捕获探针偶联的磁球配置成磁球溶液，加入信号探针和待测样本进行核酸杂交；C，核酸杂交结束后进行磁分离，然后将磁球重悬于低金属离子的溶液中；D，再次进行磁分离，对获得上清液进行检测，判断待检样本中是否存在单碱基突变；其中，所述捕获探针与目标基因的非突变部分完全互补；所述信号探针与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配；所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针、富含G序列的信号探针或等温指数扩增引物的信号探针。根据本专利技术，当所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针时，检测上清液中的荧光值，若荧光值超过背景噪音的6倍，则待检样本中存在单碱基突变；当所述信号探针的类型为富含G序列的信号探针时，在上清液中加入氯化血红素、H2O2和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐进行显色反应，若反应液呈现绿色，则待检样本中存在单碱基突变；当所述信号探针的类型为等温指数扩增引物的信号探针时，利用上清液进行等温指数扩增反应，若扩增过程中出现扩增曲线，则待检样本中存在单碱基突变。在本专利技术的一些实施例中，所述磁球溶液中的金属离子浓度为200-400mM；和/或所述低金属离子的溶液中的金属离子浓度为0-10mM。在本专利技术的另一些实施例中，所述的金属离子为Na和/或K。在本专利技术的一些实施例中，所述信号探针与目标基因互补的碱基个数为9-12个。在本专利技术的另一些实施例中，所述捕获探针的长度为20-25个碱基。根据本专利技术，在捕获探针上标记生物素，在磁球表面包覆亲和素，通过生物素-亲和素的相互作用，将捕获探针偶联于磁球上。在本专利技术的一些实施例中，所述磁球的平均直径为2μm。在本专利技术的另一些实施例中，所述核酸杂交的温度为20-27℃，时间为10-20min。根据本专利技术，所述方法对单碱基突变的检测限为0.1％。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述方法可以快速准确地对单碱基突变基因序列进行检测，且对单碱基突变基因序列具有高度的选择性，可用于低丰度突变检测。同时，所述方法还具有荧光、显色和等温扩增信号等多个检测窗口，可以适用于多种检测环境；且检测成本低廉、易于制备，操作简便，重复性高，易于推广到非专业人员操作。附图说明下面将结合附图来说明本专利技术。图1为与目标基因互补的碱基个数为10的信号探针在不同浓度的NaCl存在时的单碱基突变区分因子的示意图。图2为不同丰度的单碱基突变基因与检测荧光值的关系示意图。图3为本专利技术采用荧光标记的信号探针进行单碱基突变检测的原理示意图；其中，图中附图标记的含义如下：1目标基因的突变型基因；2目标基因的野生型基因；3生物素化捕获探针；4亲和素包覆的磁球；5荧光标记的信号探针。图4为实施例1中显色反应实验结果示意图。图5为实施例1中等温扩增实验结果示意图。具体实施方式为使本专利技术容易理解，下面将结合附图详细说明本专利技术。本专利技术涉及一种单碱基突变检测方法，具体为一种采用核酸短暂杂交与磁分离相结合的单碱基突变检测方法，其包括以下步骤：A，根据目标基因设计捕获探针与信号探针；所述捕获探针为单链寡核酸序列，一般为20-25个碱基，能与目标基因的非突变部分完全互补，用于捕获体系中的目标基因序列；室温下，所述捕获探针与目标基因的突变型基因和野生型基因均能形成稳定杂交；将捕获探针用生物素标记后，其能通过生物素-亲和素(例如，链霉亲和素)相互作用偶联在亲和素包覆的磁球(平均直径2微米)上；所述信号探针为一段带有标记的核苷酸序列，与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配；一般，信号探针与目标基因互补的碱基个数为9-12个；根据信号探针所带的标记不同，所述信号探针的类型包括荧光标记的信号探针、富含G序列的信号探针或等温指数扩增引物的信号探针；本专利技术所述用语“荧光标记的信号探针”是指在信号探针的端部连接一荧光素，所述的荧光素可以为FAM荧光素、VIC荧光素等。本专利技术所述用语“富含G序列的信号探针”是指在信号探针的端部连接一段富含鸟嘌呤(G)序列的信号探针，富含鸟嘌呤(G)序列的DNA能通过Hoogsteen氢键，形成G-四联体(DNA的一种二级结构)，G-四联体可以与氯化血红素(hemin)结合，形成具有过氧化氢酶活性的DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单碱基突变检测方法，其包括以下步骤：A，根据目标基因设计捕获探针与信号探针；B，将与捕获探针偶联的磁球配置成磁球溶液，加入信号探针和待测样本进行核酸杂交；C，核酸杂交结束后进行磁分离，然后将磁球重悬于低金属离子的溶液中；D，再次进行磁分离，对获得上清液进行检测，判断待检样本中是否存在单碱基突变；其中，所述捕获探针与目标基因的非突变部分完全互补；所述信号探针与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配；所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针、富含G序列的信号探针或等温指数扩增引物的信号探针。

【技术特征摘要】
1.一种单碱基突变检测方法，其包括以下步骤：A，根据目标基因设计捕获探针与信号探针；B，将与捕获探针偶联的磁球配置成磁球溶液，加入信号探针和待测样本进行核酸杂交；C，核酸杂交结束后进行磁分离，然后将磁球重悬于低金属离子的溶液中；D，再次进行磁分离，对获得上清液进行检测，判断待检样本中是否存在单碱基突变；其中，所述捕获探针与目标基因的非突变部分完全互补；所述信号探针与目标基因的突变型基因完全互补，与目标基因的野生型基因形成单碱基错配；所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针、富含G序列的信号探针或等温指数扩增引物的信号探针。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述信号探针的类型为荧光标记的信号探针时，检测上清液中的荧光值，若荧光值超过背景噪音的6倍，则待检样本中存在单碱基突变；当所述信号探针的类型为富含G序列的信号探针时，在上清液中加入氯化血红素、H2O2和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐进行显色反应，若反应液呈现绿色，则待检样本中存在单碱基突变；当所述信号探针的类型为等温指数扩增引物的信号探针时，...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏昕，喻长远，王俊秀，周旭，王磊，李泽浩，郝丹丹，李丽丹，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11