本发明专利技术公开了一种快速检测暗纹东方鲀幼鱼性别差异单碱基突变的引物和方法，本发明专利技术针对暗纹东方鲀雌雄个体性别差异基因上存在单核苷酸突变位点，设计了分别扩增性别差异基因序列的一对外侧PCR引物和含有针对突变位点的错配碱基的内侧PCR引物。利用所述引物，暗纹东方鲀不同性别DNA样品可以得到不同扩增结果，从而判断暗纹东方鲀性别差异。本发明专利技术成本低廉、操作简单、快速、准确并适合于推广应用，可在提取1龄以内暗纹东方鲀基因组DNA的基础上快速准确对暗纹东方鲀幼鱼的性别进行鉴定，对加快暗纹东方鲀单性选育进程及分子生物学领域快速的PCR检测方法研究有着重要的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一种快速检测暗纹东方鈍幼鱼性别差异单碱基突变的引物和方法
本专利技术涉及一种快速检测暗纹东方飩幼鱼性别差异单碱基突变的引物和方法。
技术介绍
暗纹东方飩(Takifugu),俗称河豚,属硬骨鱼纲,飩形目，飩科,东方飩属，主要分布在我国近海北部沿海(东海、黄海、渤海)和长江中下游，具有溯河洄游的习性，成鱼在海中育肥和成熟，春季亲鱼由海逆河而上到淡水中产卵，仔稚鱼在长江和湖泊中发育成长，翌年春天幼鱼入海。暗纹东方飩本身不产生毒素，但是可以蓄积所捕食的饵料生物中的毒素，尤以卵巢、肝脏、血液和皮肤等部位含量较高，误食没有经过特殊处理和烹饪的野生暗纹东方飩，可致人死亡。然而暗纹东方飩肉质鲜美，营养丰富，特别是其精巢不仅不含毒素，而且洁白如乳，丰腴鲜美，入口即化，给人以难以用言辞表达的美妙绝伦的感觉，有“西施乳”之美誉。暗纹东方飩在我国有2000多年的食用历史，与鋪鱼、刀鱼并称为“长江三鲜”，颇受江苏、上海一带消费者的尊崇，素有“拼死吃河豚”和“不吃河豚不知鱼味，吃河豚百味皆无”等说法，足见暗纹东方飩在长江流域饮食文化中的重要地位。 由于暗纹东方飩可进入江河或定居于淡水湖中，造成了养殖环境的不同，适合于淡水养殖的暗纹东方飩和适合于海水养殖的红鳍东方飩在水溶性及挥发性风味上存在着较大差异，从而影响着人们的食用喜好。国内食用较多的品种为淡水养殖的暗纹东方飩，而出口较多的品种为海水养殖的红鳍东方飩。2007年全国河豚鱼养殖就达到了淡水养殖和海水养殖分别为1404吨和10141吨的产量。 但是由于过度捕捞导致野生暗纹东方飩捕捞量严重下滑，不能满足消费者的主球，我国从20世纪90年代初期开始人工养殖暗纹东方飩，目前养殖范围遍及江苏、广东和上海等十多个省市，养殖年产量接近4万t，暗纹东方飩的养殖也已成为上述省市的一项重要的水产养殖产业。由于暗纹东方飩属于有毒鱼类，在我国的食用受到限制，妨碍了暗纹东方飩养殖的可持续发展。因此，研究全雄苗种的制种技术，养殖全雄暗纹东方飩，可以充分利用雄鱼精巢无毒、市场价格高以及可以作为高档化妆品鱼精蛋白的加工原料等优势，对于提高养殖利润和促进产业发展都有重要意义。 迄今为止，有关暗纹东方飩全雄苗种培育工作的研究仅限于性别分化时期、性别分化相关基因的表达规律(李延伸，戴奇，郭正龙，朱永祥，黄波，周忠良，2011.暗纹东方飩o/wctf/YAs)性别分化的组织学及芳香化酶基因表达研究.复旦学报(自然科学版)，645-652.)以及芳香化酶抑制剂对性别分化和相关芳香化酶基因表达的影响(黄波，杨小玉，戴奇，汪奇，云丹，周忠良，2013.芳香化酶抑制剂对暗纹东方飩CYP19A、DMRTl基因表达及性腺分化的影响.中国水产科学，68-74 ;汪奇，郭正龙，李延伸，云丹，黄波，周忠良，2012.来曲唑对暗纹东方飩性腺分化及相关基因表达的影响.动物学杂志，16-23.)等方面，缺乏全雄苗种制种的基础研究，包括未成熟稚幼鱼性别的无损鉴定方法，特别是雌雄性别差异单碱基突变的等位基因特异PCR方法以及弓丨物国内外尚未见报道。 随着测序技术的不断发展，多种生物的全基因组测序工作宣告完成，决定生物多样性的遗传信息得以揭示，这为各类生物个体差异的鉴定和研究提供了广泛依据。核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)是指群体中基因组DNA序列上单个核苷酸的变异，生物中的SNP数量多、分布广、高度稳定，并且易于分型，是开发新型分子标记的重要遗传基础。目前，基于SNP的分子标记已经在人类、拟南芥、水稻基因组中大量开发。此外，根据群体中的SNP设计等位基因特异引物，针对性的建立等位基因特异PCR(Allele-specific PCR, AS-PCR)，是检测己知突变位点SNP的一种快速、简便、低成本的有效方法，该方法能够以基因组DNA为模板，仅仅通过简单的PCR和电泳结果就能够进行基因型的鉴定，从而克服其他方法操作较繁琐，耗时较长的缺点，尤其适合于对大样本进行快速鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种快速检测暗纹东方飩幼鱼性别差异单碱基突变的引物和方法，本专利技术针对暗纹东方飩雌雄个体雌雄性别差异基因上单核苷酸突变位点，设计了分别扩增雌雄性别差异基因序列的一对上、下游PCR引物和含有针对突变位点的错配碱基的下游PCR引物，其中一条含有错配碱基的下游PCR引物，该引物的3’端碱基序列位于突变位点上。利用所述引物，采用双重PCR方法对暗纹东方飩不同性别DNA样品可以得到不同的扩增结果，从而判断暗纹东方飩雌雄性别差异。利用本专利技术所述技术方案能够快速、准确地对暗纹东方飩未成熟幼鱼的性别进行鉴定。 为实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案予以实现:本专利技术提供了一种快速检测暗纹东方飩幼鱼性别差异单碱基突变的引物，所述引物包括扩增雌雄性别差异基因序列的上游引物AWF、下游引物AWR和含有针对单碱基突变位点的错配碱基的下游引物Inner Reverse, 所述上游引物 AWF:5’ - GGCTACCAGAGAAGCTACAAC -3’ ； 所述下游引物 AWR:5’ - TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC -3’ ； 所述下游引物Inner Reverse: 5’- TGCTTCCGATACCATCTGTTGTGCAGATC -3’ 。 对上述技术方案的进一步改进:所述单碱基突变位点位于暗纹东方飩BMPR2基因上。 本专利技术还提供了利用所述引物快速检测暗纹东方飩幼鱼雌雄性别差异单碱基突变的方法，它包括以下步骤:采集待测暗纹东方飩幼鱼样品，提取暗纹东方飩幼鱼的全基因组DNA ;采用所述上游引物AWF和下游引物AWR进行第一轮PCR扩增，进行电泳检测，呈现545bp条带的为雌雄性别差异基因序列，将第一轮PCR产物稀释后作为模板，采用所述上游引物AWF和下游引物Inner Reverse进行第二轮PCR扩增，进行电泳检测，扩增出341bp条带的为暗纹东方飩雄性个体，该位置无扩增条带的为暗纹东方飩雌性个体。 对上述技术方案的进一步改进:第一轮PCR扩增体系为25PL反应体系，包括浓度ΙΟμΜ的引物AWF和引物AWR各为?μ?，浓度2.5mM的dNTP Ιμ?,浓度5U/^L的Taq DNA聚合酶 0.5μ?，含 Mg2+ 15 μΜ 的 1X Buffe 2.5μ?，DNA 模板 ?μ?，去离子水 18μ?。 对上述技术方案的进一步改进:所述第一轮PCR反应条件为:预变性95°C 5min,变性94°C 60s，退火58°C 45s，延伸72°C 45s，共35个循环，最后72°C延伸5 min。 对上述技术方案的进一步改进:第二轮PCR扩增体系为25μ?反应体系，包括浓度ΙΟμΜ的引物AWF和引物AWR各为?μ?，浓度2.5mM的dNTP Ιμ?,浓度5U/^L的Taq DNA聚合酶 0.5μ?，含 Mg2+ 15 μΜ 的 1X Buffe 2.5μ?，DNA 模板 ?μ?，去离子水 18μ?。 对上述技术方案的进一步改进:所述第二轮PCR反应条件为:预变性95°C lmin,变性94°C 60s，退火64°C 45s，延本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测暗纹东方鲀幼鱼性别差异单碱基突变的引物，其特征在于：所述引物包括扩增性别差异基因序列的上游引物AWF、下游引物AWR和含有针对单碱基突变位点的错配碱基的下游引物Inner Reverse：所述上游引物AWF：5’‑ GGCTACCAGAGAAGCTACAAC ‑3’；所述下游引物AWR：5’‑ TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC ‑3’；所述下游引物Inner Reverse：5'‑ TGCTTCCGATACCATCTGTTGTGCAGATC ‑3'。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测暗纹东方飩幼鱼性别差异单碱基突变的引物，其特征在于:所述引物包括扩增性别差异基因序列的上游引物AWF、下游引物AWR和含有针对单碱基突变位点的错配碱基的下游引物Inner Reverse: 所述上游引物 AWF:5’ - GGCTACCAGAGAAGCTACAAC -3’ ； 所述下游引物 AWR:5’ - TCCCAGCTCAGAGACAGATGGC -3’ ； 所述下游引物Inner Reverse:5’- TGCTTCCGATACCATCTGTTGTGCAGATC -3’ 。2.根据权利要求1所述的快速检测暗纹东方飩幼鱼性别差异单碱基突变的引物，其特征在于:单碱基突变位点位于暗纹东方飩BMPR2基因上。3.利用权利要求1所述引物快速检测暗纹东方飩幼鱼性别差异单碱基突变的方法，其特征在于它包括以下步骤: 采集待测暗纹东方飩幼鱼样品，提取暗纹东方飩幼鱼的全基因组DNA ;采用所述上游引物AWF和下游引物AWR进行第一轮PCR扩增，进行电泳检测，呈现545bp条带的为性别差异基因序列；将第一轮PCR产物稀释后作为模板，采用所述上游引物AWF和下游引物InnerReverse进行第二轮PCR扩增，进行电泳检测，扩增出341bp条带的为暗纹东方飩雄性个体，该位置无扩增条带的为暗纹东方飩雌性个体。4.根据权利要求3所述的快速检测暗纹东方飩幼鱼性别差异单碱基突变的方法，其特征在于:第一轮PCR扩增体系为25μ?反...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘滨，胡鹏，刘新富，孟振，杨志，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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