一种DNA催化循环网络诱导的DNA‑纳米金组装方法及其在单碱基突变检测中的应用技术

本发明专利技术涉及一种DNA催化循环网络诱导的DNA‑纳米金组装方法以及此种方法在单碱基突变检测中的应用。本发明专利技术提供的检测手段操作方便，在常温下反应即可，尤其是DNA‑纳米金复合物是非特异性的，无需重新制备，极大地降低了实验工作量的同时也方便此技术用于不同DNA目标链的检测。在实际检测中通过颜色差异以及紫外可见分光光度计就可以进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法及其在单碱基突变检测中的应用
本专利技术涉及DNA分子检测
，具体涉及一种DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法以及此种方法在单碱基突变检测中的应用。
技术介绍
单碱基突变是一种普遍存在的基因变异种类，在人类基因组中几乎有1％的等位基因会出现单碱基突变。单碱基突变的检测现在也开始越来越受关注，因为在人类DNA基因序列中的变异对疾病的诊断以及药物设计都具有很大的意义。目前为止，实现单碱基突变检测的方法有很多种，其中重要的方法有酶辅助方法以及DNA杂交的方法。酶辅助的方法可以在室温下操作并且具有很高的灵敏度以及强的特异性，但是操作的过程复杂，反应体系的特异性跟酶的活性相关。在DNA杂交的方法中主要存在荧光标记方法以及纳米金标记的比色法，纳米金比色法相对于荧光标记的方法的优势在于可以有效的克服荧光淬灭的影响并且无需使用复杂的仪器设备检测。在目前已经实现的纳米金辅助的DNA单碱基突变检测手段中主要有纳米金均相反应体系以及纳米金颗粒参与的微阵列体系。利用纳米金的均相反应实现单碱基突变的检测技术首先由Mirkin提出[MirkinCA.Science1997.227,1078]，该技术的关键则是利用互补的杂交链存在发生单碱基突变以后Tm值的变化，通过控制实验温度就可以有效区分开存在单碱基突变的体系。而纳米金参与的微阵列体系[MirkinCA.Science2000.289,1757]具有更高的灵敏度。但是操作中反复的冲洗步骤是实验的关键所在，因此增加了该技术在实际应用中的难度。
技术实现思路
为了克服现有技术中在DNA单碱基突变上检测的困难，本专利技术人进行了深入研究，专利技术了一种DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法，本方法操作简单，并且实验用到的DNA-纳米金复合物无需重新制备，只要变化DNA催化循环网路就可满足于不同DNA检测的需求，这极大地降低了实验工作量的同时也让该方法变得更为简便实用。此方法在单碱基突变的检测中效果十分突出，与完全互补目标链相比发生单碱基突变的DNA目标链实验现象差异巨大，不同单碱基突变位点发生的任何突变(错配，插入，删除)在此方法中均可实现检测。因此，相信此方法可以在以后应用于实际检测中。具体地，本专利技术提供以下各项：1.一种DNA催化循环网络诱导DNA-纳米金组装的试剂盒，其中包括：1)DNA底物链，所述DNA底物链由连接链和保护链杂交而成，其中所述连接链从5’端到3’端依次由区域1、区域2、区域3、区域4、区域5连接而成，所述保护链从3’端到5’端依次由任选的区域a*、区域2*、区域3*、区域4*、区域6*连接而成，其中，区域2、区域3、区域4组成的连接链中间部分与区域2*、区域3*、区域4*组成的保护链中间部分完全互补，保护链除任选的区域a*和区域2*外的其它部分与目标链互补，区域6*为触发DNA链替换反应的粘性末端；2)燃料链，所述燃料链为与保护链互补的单链DNA；3)连接有纳米金1的DNA双链1和连接有纳米金2的DNA双链2，其中，所述DNA双链1由纳米金连接链1和纳米金保护链1杂交而成，所述DNA双链2由纳米金连接链2和纳米金保护链2杂交而成，所述纳米金连接链1从3’端到5’端依次由区域7*、区域1*、区域2*连接而成，所述纳米金保护链1由区域1组成，所述纳米金连接链2从3’端到5’端依次由区域4*、区域5*、区域8*连接而成，所述纳米金保护链2由区域5组成，其中，所述DNA双链1和所述DNA双链2分别通过区域7*或区域8*与连接有区域7或区域8的纳米金1和纳米金2相连，并且DNA双链1中的纳米金连接链1的区域1*和区域2*与步骤1)所述连接链的区域1和区域2互补，DNA双链2中的纳米金连接链2的区域4*和区域5*与步骤1)所述连接链的区域4和区域5互补；其中区域1与区域1*、区域2与区域2*、区域3与区域3*、区域4与区域4*、区域5与区域5*、区域6与区域6*、区域7与区域7*、区域8与区域8*分别完全互补。2.根据1所述的试剂盒，其中所述燃料链的两端分别含有碱基错配。3.根据2所述的试剂盒，所述碱基错配的位置是燃料链中区域2和区域4部分与区域3相连部分的第一个碱基。4.根据2所述的试剂盒，其中所述燃料链两端与保护链互补的粘性末端分别增加1-3个碱基，形成区域a和区域b。5.根据1所述的试剂盒，所述目标链的长度范围在10-50个碱基之间。6.一种DNA催化循环网络诱导DNA-纳米金组装的方法，所述方法包括以下步骤：1)根据需要检测的DNA目标链来设计1-5任一项所述试剂盒中的各条链的DNA序列；2)使用步骤1)中获得的试剂盒中的各条链在DNA目标链样品中完成DNA-纳米金的组装.7.一种检测DNA单碱基突变的方法，所述方法包括如下步骤：1)根据需要检测的DNA目标链来设计1-5任一项所述试剂盒中的各条链的DNA序列；2)使用步骤1)中获得的试剂盒中的各条链在DNA目标链和突变链样品中完成DNA-纳米金的组装；3)根据DNA-纳米金组装的紫外动力学过程和颜色差异检测DNA单碱基突变。8.根据6或7所述的方法，其中燃料链与底物链的摩尔比在5：1到10：1之间。9.根据6或7所述的方法，其中所述DNA-纳米金的组装在PBS缓冲液中进行。10.根据7所述的方法，其中所述单碱基突变包括错配、插入和删除。本专利技术中，除了修饰在纳米金表面的DNA系列长度为固定长度，并与检测目标链无关无需重新设计之外，其他DNA序列的长度根据实际检测目标链的长度而定。所述修饰在纳米金表面的DNA的长度优选为31个碱基。专利技术详述本专利技术第一个方面提供一种DNA催化循环网络诱导的DNA-纳米金组装方法，原理如图1所示：其中，保护链与连接链杂交经过纯化后形成底物，底物上的区域6*为触发DNA链替换反应的粘性末端，目标链上的区域6与之互补，目标链可以将底物中的连接链替换下来，燃料链为DNA链替换提供动力，也就是说燃料链会将目标链替换下来让目标链DNA继续发挥作用，使得DNA催化循环网络得以运行。被目标链替换下来的连接链会引发DNA-纳米金的组装，首先连接链上的区域2和区域4会分别与纳米金连接链-1中的区域2*以及纳米金连接链-2中的区域4*发生作用，然后连接链会将纳米金保护链-1和纳米金保护链-2替换下来从而将纳米金-1和纳米金-2连接起来。特别需要指出的是在实验和过程中需要加入大量的燃料链，但是实验发现在高浓度条件下，燃料链中的区域2和区域4会分别与纳米金连接链-1中的区域2*以及纳米金连接链-2中的区域4*相连接导致DNA-纳米金发生聚集，也就是在没有加入目标链的情况下纳米金体系就已经发生组装，此种情况下纳米金连接链-1中的区域2*和纳米金连接链-2中的区域4*中的碱基个数均为5。为了防止这种现象，我们对燃料链进行改进，将燃料链中的区域2和区域4部分与区域3相连部分的第一个碱基发生错配，这样就不会导致在加入燃料链的情况下发生DNA-纳米金聚集的情况。此外，为了保证燃料链的替换能力不下降，我们在保证整个系统稳定的前提下将发生错配的燃料链两端的与保护链互补的粘性末端的碱基增加了3个，将其命名为区域a和区域b。另一方面，本专利技术提供了一种基于DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA催化循环网络诱导DNA‑纳米金组装的试剂盒，其中包括：1)DNA底物链，所述DNA底物链由连接链和保护链杂交而成，其中所述连接链从5’端到3’端依次由区域1、区域2、区域3、区域4、区域5连接而成，所述保护链从3’端到5’端依次由任选的区域a*、区域2*、区域3*、区域4*、区域6*连接而成，其中，区域2、区域3、区域4组成的连接链中间部分与区域2*、区域3*、区域4*组成的保护链中间部分完全互补，保护链除任选的区域a*和区域2*外的其它部分与目标链互补，区域6*为触发DNA链替换反应的粘性末端；2)燃料链，所述燃料链为与保护链互补的单链DNA；3)连接有纳米金1的DNA双链1和连接有纳米金2的DNA双链2，其中，所述DNA双链1由纳米金连接链1和纳米金保护链1杂交而成，所述DNA双链2由纳米金连接链2和纳米金保护链2杂交而成，所述纳米金连接链1从3’端到5’端依次由区域7*、区域1*、区域2*连接而成，所述纳米金保护链1由区域1组成，所述纳米金连接链2从3’端到5’端依次由区域4*、区域5*、区域8*连接而成，所述纳米金保护链2由区域5组成，其中，所述DNA双链1和所述DNA双链2分别通过区域7*或区域8*与连接有区域7或区域8的纳米金1和纳米金2相连，并且DNA双链1中的纳米金连接链1的区域1*和区域2*与步骤1)所述连接链的区域1和区域2互补，DNA双链2中的纳米金连接链2的区域4*和区域5*与步骤1)所述连接链的区域4和区域5互补；其中区域1与区域1*、区域2与区域2*、区域3与区域3*、区域4与区域4*、区域5与区域5*、区域6与区域6*、区域7与区域7*、区域8与区域8*分别完全互补。...

【技术特征摘要】
1.一种DNA催化循环网络诱导DNA-纳米金组装的试剂盒，其中包括：1)DNA底物链，所述DNA底物链由连接链和保护链杂交而成，其中所述连接链从5’端到3’端依次由区域1、区域2、区域3、区域4、区域5连接而成，所述保护链从3’端到5’端依次由任选的区域a*、区域2*、区域3*、区域4*、区域6*连接而成，其中，区域2、区域3、区域4组成的连接链中间部分与区域2*、区域3*、区域4*组成的保护链中间部分完全互补，保护链除任选的区域a*和区域2*外的其它部分与目标链互补，区域6*为触发DNA链替换反应的粘性末端；2)燃料链，所述燃料链为与保护链互补的单链DNA，其中所述燃料链的两端分别含有碱基错配，所述碱基错配的位置是燃料链中区域2和区域4部分与区域3相连部分的第一个碱基，并且，其中所述燃料链两端与保护链互补的粘性末端分别增加1-3个碱基，形成区域a和区域b；3)连接有纳米金1的DNA双链1和连接有纳米金2的DNA双链2，其中，所述DNA双链1由纳米金连接链1和纳米金保护链1杂交而成，所述DNA双链2由纳米金连接链2和纳米金保护链2杂交而成，所述纳米金连接链1从3’端到5’端依次由区域7*、区域1*、区域2*连接而成，所述纳米金保护链1由区域1组成，所述纳米金连接链2从3’端到5’端依次由区域4*、区域5*、区域8*连接而成，所述纳米金保护链2由区域5组成，其中，所述DNA双链1和所述DNA双链2分别通过区域7*或区域8*与连接有区域7或区域...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁好均，姚东宝，肖石燕，宋廷结，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34