本发明专利技术公开了尿酸氧化酶突变体及其在提高尿酸氧化酶热稳定性和胰蛋白酶抗性中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术公开的尿酸氧化酶突变体为Y47F/T68L/T75W/D111G/K204F/F259I/K299E、T68L/T75W/K204F/K299E或T68L/T75W/K299E。本发明专利技术通过定向进化结合高通量筛选、多重虚拟筛选等方式挖掘影响热稳定性的关键位点，并通过突变提升稳定性；通过分子动力学模拟和溶剂可及表面积计算的方式挖掘影响抗酶解性能的关键位点，并通过突变提升抗酶解效果。最终挖掘出多个影响稳定性和抗酶解性能的关键位点与突变体，并获得了热稳定性和抗酶解性能的提升。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，更具体的说是涉及尿酸氧化酶突变体及其在提高尿酸氧化酶热稳定性和胰蛋白酶抗性中的应用。
技术介绍
1、尿酸氧化酶是生物体内嘌呤代谢的关键酶之一，能够将尿酸转化为尿囊素，成为了一种具有优良治疗效果的蛋白类药物。然而天然的尿酸氧化酶存在着热稳定性差，抗蛋白酶水解性能差等问题。因此需要通过分子改造的手段提升尿酸氧化酶的热稳定性和抗酶解性能。
2、热稳定性的改造可以通过定向进化和高通量筛选相结合的方式，以微孔板为载体进行随机突变文库的筛选；也可以采用b-factor策略，通过计算寻找高柔性区域并进行刚性化设计来提升稳定性。近年来，许多计算设计平台被设计出来，例如fireprot、pross、grape等，他们整合了共识序列分析、解折叠态自由能计算等模块来实现突变位点的快速寻找，已在多个酶的稳定性改造上得到了实验和验证。
3、抗酶解改造也是蛋白类药物设计过程中需要解决的难题，目前针对蛋白质分子本身的抗酶解改造主要分为直接突变和间接提升两个方向。直接突变可以通过分子对接和溶剂可及表面积计算的方式，针对性的找到与蛋白酶直接接触的切割位点，并通过突变延缓蛋白酶水解过程；间接提升可以通过突变切割位点附近的残基，在空间上形成对切割位点掩蔽，从而降低切割位点与蛋白酶接触的概率，也可以通过人工设计n-糖基化修饰从而阻断蛋白酶与其切割位点的接触，以此达到抵抗蛋白酶水解的目的。
4、因此，提供尿酸氧化酶突变体及其在提高尿酸氧化酶热稳定性和胰蛋白酶抗性中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
/>技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了尿酸氧化酶突变体及其在提高尿酸氧化酶热稳定性和胰蛋白酶抗性中的应用。
2、本专利技术采用定向进化、理性设计的方式挖掘影响尿酸氧化酶热稳定性的关键点突变，再通过组合突变、迭代进化等方式大幅提升了尿酸氧化酶的热稳定性。同时，该过程也提升了尿酸氧化酶的活性和抗胰蛋白酶水解性能。进一步采用溶剂可及表面积计算的策略识别大概率暴露在水环境中的切割位点，挖掘影响抗胰蛋白酶水解性能的位点，通过组合突变抗酶解性能获得了大幅提升。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、尿酸氧化酶突变体，为y47f/t68l/t75w/d111g/k204f/f259i/k299e（m7）、t68l/t75w/k204f/k299e（m4*）、t68l/t75w/k299e（m3*）、t68l/t75s/e222d/k299e（m4）、t68l/t75s/k299e（m3）、t75s/k299e（m2）、t75w、k299e、k91r、t68l、d184w、k204f、d134f、a97k或e222d；
5、所述尿酸氧化酶（uox）的氨基酸序列如seq id no.1所示。
6、msavkaarygkdnvrvykvhkdektgvqtvyemtvcvllegeietsytkadnsvivatdsikntiyitakqnpvtppelfgsilgthfiekynhihaahvnivchrwtrmdidgkphphsfirdseekrnvqvdvvegkgidiksslsgltvlkstnsqfwgflrdeyttlketwdrilstdvdatwqwknfsglqevrshvpkfdatwatarevtlktfaednsasvqatmykmaeqilarqqlietveyslpnkhyfeidlswhkglqntgknaevfapqsdpnglikctvgrsslkskl；seq id no.1。
7、进一步，所述尿酸氧化酶突变体为y47f/t68l/t75w/d111g/k204f/f259i/k299e（m7）、t68l/t75w/k204f/k299e（m4*）或t68l/t75w/k299e（m3*）。
8、进一步，所述的尿酸氧化酶突变体的相关生物材料，为下述（1）-（4）中的至少一种：
9、（1）编码尿酸氧化酶突变体的核酸分子；
10、（2）含有（1）所述核酸分子的表达盒；
11、（3）含有（1）所述核酸分子的重组载体或含有（2）所述表达盒的重组载体；
12、（4）含有（1）所述核酸分子的重组微生物、含有（2）所述表达盒的重组微生物或含有（3）所述重组载体的重组微生物。
13、进一步，所述的尿酸氧化酶突变体或所述的相关生物材料在提高尿酸氧化酶热稳定性中的应用。
14、进一步，所述的尿酸氧化酶突变体在提高尿酸氧化酶热稳定性和胰蛋白酶抗性中的应用。
15、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了尿酸氧化酶突变体及其在提高尿酸氧化酶热稳定性和胰蛋白酶抗性中的应用，通过定向进化结合高通量筛选、多重虚拟筛选等方式挖掘影响热稳定性的关键位点，并通过突变提升稳定性；通过分子动力学模拟和溶剂可及表面积计算的方式挖掘影响抗酶解性能的关键位点，并通过突变提升抗酶解效果。最终挖掘出多个影响稳定性和抗酶解性能的关键位点与突变体，并获得了热稳定性和抗酶解性能的提升。
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【技术保护点】
1.尿酸氧化酶突变体，其特征在于，为Y47F/T68L/T75W/D111G/K204F/F259I/K299E、T68L/T75W/K204F/K299E、T68L/T75W/K299E、T68L/T75S/E222D/K299E、T68L/T75S/K299E、T75S/K299E、T75W、K299E、K91R、T68L、D184W、K204F、D134F、A97K或E222D；
2.根据权利要求1所述的尿酸氧化酶突变体，其特征在于，所述尿酸氧化酶突变体为Y47F/T68L/T75W/D111G/K204F/F259I/K299E、T68L/T75W/K204F/K299E或T68L/T75W/K299E。
3.权利要求1所述的尿酸氧化酶突变体的相关生物材料，其特征在于，为下述（1）-（4）中的至少一种：
4.权利要求1-2任一项所述的尿酸氧化酶突变体或权利要求3所述的相关生物材料在提高尿酸氧化酶热稳定性中的应用。
5.权利要求2所述的尿酸氧化酶突变体在提高尿酸氧化酶热稳定性和胰蛋白酶抗性中的应用。
【技术特征摘要】
1.尿酸氧化酶突变体，其特征在于，为y47f/t68l/t75w/d111g/k204f/f259i/k299e、t68l/t75w/k204f/k299e、t68l/t75w/k299e、t68l/t75s/e222d/k299e、t68l/t75s/k299e、t75s/k299e、t75w、k299e、k91r、t68l、d184w、k204f、d134f、a97k或e222d；
2.根据权利要求1所述的尿酸氧化酶突变体，其特征在于，所述尿酸氧化酶突变体为y47...
【专利技术属性】
技术研发人员：谭天伟，朱文龙，刘珞，陈国华，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：
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