一种用于检测K‑RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测K‑RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：K引物组、E‑4引物组、K检测探针、E‑4检测探针和内标检测探针；K检测探针和E‑4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E‑4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团。本发明专利技术以人类K‑RAS基因突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测K‑RAS基因突变，而且检测突变的能力高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。
技术介绍
K-ras基因是在1964年从大鼠肉瘤急性反转录病毒中分离出来的，发现它们能够进行细胞转化，该基因在真核细胞的生长过程中起着重要的作用。遗传学、生化及分子生物学等方面的研究表明，K-ras基因在细胞外刺激所产生的信号传导通路中处于中枢地位，K-ras基因活性物与细胞增殖、凋亡之间关系密切。K-ras基因突变使本应正常死亡的细胞的生存期延长，还能增加抗药物和紫外光诱导的凋亡。结肠癌、肺癌、胰腺癌常带有K-ras基因突变，K-ras基因第12、13位密码子突变约占其突变的95％，其它突变在第61等密码子上。K-ras基因在燕麦细胞癌中突变率占33％，结肠癌占44％，胰腺癌占90％。K-ras是最容易被激活的原癌基因之一，在所有人类肿瘤中K-ras突变率能达到17％至25％。K-ras基因易激活的主要区域包括密码子12、13、25、61和63。这些突变激活能导致RAS蛋白聚集，影响GTP结合状态，从而抑制GTP酶活性和阻抑GTP酶激活蛋白。利用K-ras基因在临床上可对肿瘤(包括癌前病变)进行诊断，预后评估和治疗。通过检测基因突变来推测肿瘤所处的阶段和分化的程度，从而对病情和预后进行评估。随着现在医药行业的发展，已开发出针对肿瘤病变的多种阻断细胞信号通路的药物，但是在使用这些药物时需要确保该信号通路的下游信号分子没有发生激活突变，而这往往正是现在医疗行业需面对的问题，急需一种快速、简便、安全、高灵敏、高通量和低成本的K-ras基因突变检测来辅助这些药物的临床运用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒。本专利技术的技术方案如下：一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：K引物组、E-4引物组、K检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；K检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，K引物组由正向引物K-M1-F、K-M2-F、K-M3-F、K-M4-F、K-M5-F、K-M6-F、K-M7-F和反向引物K-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01至08所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO09和10所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：K引物组的一正向引物和一反向引物K检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测荧光信号。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述K检测探针为K-P-C，包括如SEQIDNO11所示的序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述E-4检测探针为E-4-P，所述内标检测探针为E-4-I，均包括如SEQIDNO12所示的序列。上述各因物及探针具体序列如下表所示：进一步优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ。本专利技术的有益效果：1、本专利技术的试剂盒可用于辅助临床医生筛选出可受益于Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)等药物的大肠癌等癌症患者，适合于患者在进入个体化靶向治疗疗程之前使用，可为患者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。2、本专利技术以人类K-RAS基因突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测K-RAS基因突变，而且检测突变的能力高。附图说明图1为本专利技术实施例2的多重荧光PCR反应程序图。图2为本专利技术实施例2中多重荧光PCR检测K-RAS基因GLY12ASP突变阴性对照样品检测曲线图。图3为本专利技术实施例2中多重荧光PCR检测K-RAS基因GLY12ASP突变的样品检测曲线图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，包括：K引物组、E-4引物组、K检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；K检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；优选的，所述第一荧光报告基团为FAM，所述第一荧光猝灭基团为BHQ，所述第二荧光报告基团为HEX、ROX或VIC，第二荧光猝灭基团为BHQ；其中，K引物组由正向引物K-M1-F、K-M2-F、K-M3-F、K-M4-F、K-M5-F、K-M6-F、K-M7-F和反向引物K-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01至08所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO09和10所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：K引物组的一正向引物和一反向引物K检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl2dNTPsTaq酶H2ODNA模板；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的反应条件均为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，64℃退火20s，72℃延伸15s，15个循环；95℃变性25s，60℃退火35s，72℃延伸10s，30个循环，后30个循环在退火时检测荧光信号。所述K检测探针为K-P-C，包括如SEQIDNO11所示的序列。所述E-4检测探针为E-4-P，所述内标检测探针为E-4-I，均包括如SEQIDNO12所示的序列。上述各因物及探针具体序列如下表所示：实施例1本实施例以人类K-RAS基因外显子2的GLY12ASP突变为检测对象，通过特异引物的优化组合以及荧光探针，从而实现准确、简单、快速地同时检测GLY12ASP突变，而且检测突变的能力高达1％。野生型细胞系H460的基因组DNA为野生型模板，以GLY12ASP突变质粒为阳性对照模板，以本试剂盒进行多重PCR检测，最终以达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的标准(本实施例中的第一荧光报告基团为FAM，第二荧光报告基团为VIC、ROX或HEX，第一和第二荧光猝灭基团均为BHQ)。上述多重荧光PCR检测的扩增反应体系为：以上试剂组分：1×PCR缓冲液，MgCl2，Taq酶，dNTP均购自中国大连宝生物公司。上述多重荧光PCR检测的反应条件是95℃预变性5min，1个循环；95℃变性25s，60℃退火20s本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测K‑RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括：K引物组、E‑4引物组、K检测探针、E‑4检测探针和内标检测探针；K检测探针和E‑4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E‑4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，K引物组由正向引物K‑M1‑F、K‑M2‑F、K‑M3‑F、K‑M4‑F、K‑M5‑F、K‑M6‑F、K‑M7‑F和反向引物K‑M‑R组成，依次包括如SEQ ID NO 01至08所示的序列；E‑4引物组由正向引物E‑4‑F和反向引物E‑4‑R组成，依次包括如SEQ ID NO 09和10所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：K引物组的一正向引物和一反向引物K检测探针和/或E‑4检测探针E‑4引物组内标检测探针1×PCR缓冲液MgCl

【技术特征摘要】
1.一种用于检测K-RAS基因突变的多重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括：K引物组、E-4引物组、K检测探针、E-4检测探针和内标检测探针；K检测探针和E-4检测探针的5’端均修饰有第一荧光报告基团，3’端均修饰有第一荧光猝灭基团；内标检测探针的序列与E-4检测探针的序列相同，其5’端修饰有与第一荧光报告基团不同的第二荧光报告基团，3’端均修饰有第二荧光猝灭基团；其中，K引物组由正向引物K-M1-F、K-M2-F、K-M3-F、K-M4-F、K-M5-F、K-M6-F、K-M7-F和反向引物K-M-R组成，依次包括如SEQIDNO01至08所示的序列；E-4引物组由正向引物E-4-F和反向引物E-4-R组成，依次包括如SEQIDNO09和10所示的序列；该多重荧光PCR检测试剂盒的每一反应体系的组成如下：K引物组的一正向引物和一反向引物K检测探针和/或E-4检测探针E-4引物组内标检测探针1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈琰，郭飞飞，
申请(专利权)人：厦门飞朔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35