一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法技术

本发明专利技术涉及肿瘤转移基因检测技术领域，尤其为一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法，包括以下步骤：S1，细胞培养及脱甲基化处理；S2，肿瘤细胞的形态学观察；S3，基因组DNA的亚硫酸氢盐的修饰；S4，甲基化特异性PCR(MSP)；S5，RT

【技术实现步骤摘要】
一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法


[0001]本专利技术涉及肿瘤转移基因检测
，尤其涉及一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法。

技术介绍

[0002]癌症相关的死亡个体中，90％都是由于肿瘤转移造成的。这就强调了肿瘤转移对于病人的巨大危害性，同时也说明了通过预测肿瘤转移的风险以及提早预防肿瘤转移来降低癌症的死亡率的重要性。但是我们目前对于癌症转移的分子机制了解还是很少的。基于芯片的研究表明通过分析标志基因的表达(geneexpressionsignatures)可以在肿瘤的早期诊断中预测病人的临床表型。同样利用标志基因的表达可以帮助分析病人的转移风险。这些标志基因可以作为转移的标记(metastaticsignature)。但是人们对于肿瘤转移的机制和肿瘤转移相关的基因的了解还不够深入。
[0003]现有的肿瘤转移基因检测效果不够理想，因此提出一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法，包括以下步骤：
[0007]S1，细胞培养及脱甲基化处理；
[0008]S2，肿瘤细胞的形态学观察；
[0009]S3，基因组DNA的亚硫酸氢盐的修饰；
[0010]S4，甲基化特异性PCR(MSP)；
[0011]S5，RT
‑
PCR检测基因表达水水平；
[0012]S6，化学发光法定量检测肿瘤细胞脱甲基化处理前后基因甲基化程度；
[0013]S7，利用凝胶成像分析系统对RT
‑
PCR结果进行检测图像分析。
[0014]作为本专利技术优选的方案，所述S1用含10％小牛血清培养液37℃、5％CO2培养癌细胞株，取约3x105个细胞置入直径为100mm的培养皿中用去甲基化试剂处理(终浓度为10
‑6M)，24小时后更换培养液，以后每3天更换一次培养液，9天后收获细胞，用Trizol总RNA提取试剂盒提取DNA和RNA，以甲醛凝胶电泳和A
260
/A
280
比值判断提取RNA的完整性及纯度。
[0015]作为本专利技术优选的方案，所述S2用倒置显微镜对5
‑
Aza
‑
CdR处理前后的肿瘤细胞观察。
[0016]作为本专利技术优选的方案，所述S3取1～2ug基因组DNA，加入双蒸水至50μl，用NaOH(终浓度为0.2mol/L)37℃变性10min，向变性后的DNA中加入520μl新鲜配制的亚硫酸氧钠(pH5.0)和30μl新鲜配制的氢上面覆盖石蜡油，50℃水浴16h，修饰后的DNA用Wizard DNA纯
化试剂盒纯化溶解于50μl的双蒸水中，再加入NaOH(终浓度0.3mol/L)室温下放置5min，最后用乙醇沉淀DNA，并以适量的双蒸水重新溶解经亚硫酸氢钠修饰过的DNA，
‑
20℃贮存备用。
[0017]作为本专利技术优选的方案，所述S4单链DNA的胞嘧啶可被亚硫酸氢盐脱氨基转变为尿嘧啶，而5
‑
甲基胞嘧啶则不能被修饰，仍保持为5
‑
甲基胞嘧啶，根据5
‑
甲基胞嘧啶与胞嘧啶修饰后的不同，设计甲基化和非甲基化等位基因特异的引物，PCR扩增，2％的琼脂糖凝胶电泳检测；
[0018]PCR反应:
[0019]反应总体积50μl,包括经亚硫酸氢钠修饰后的模板DNA约50ng，引物各300ng,dNT1.25mmol/L，1.25μlDNA聚合酶，缓冲液(16.6mmol/L硫酸铵、67mmol/L Tris
‑
HclPH8.8、10mmol/L 2
‑
巯基乙醇、67mmol/LMgCl2)反应条件为95℃热启动15min,然后于95℃、30s、60℃、30s、72℃、30s各循环35次，最后于72℃延伸10min，同时以正常人外周血淋巴细胞(PBL)DNA作为阴性对照，以水作为空白对照，取扩增产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察，拍照。
[0020]作为本专利技术优选的方案，S5所述Trizol试剂一步法提取经5
‑
Aza
‑
CdR处理和未经5
‑
Aza
‑
CdR处理过细胞总RNA，紫外分光光度计测其浓度和纯度，取2ug总RNA用M
‑
MLV逆转录酶进行逆转录，再以cDNA为模板扩增P16基因，并同时扩增β
‑
actin为内参；
[0021]PCR反应条件为：94℃变性6min，94℃、1min、62℃、30s、72℃、50s，34个循环，72℃延伸7min，取扩增产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察，拍照。
[0022]作为本专利技术优选的方案，所述S6反应总体积50μl，包括经NaHSO3修饰的模板DNA约50ng，各引物300ng，dNTP为0.25mmol/L，缓冲液，扩增参数：95℃热启动10分钟，加入1.0UTaqDNA聚合酶然后于95℃、60℃、72℃各30s循环30次最后于72℃延伸6分钟；同时以正常人外周血淋巴细胞(PBL)DNA作阴性对照，以重蒸水作空白对照，以SssI处理的正常人外周血白细胞DNA作为阳性对照；
[0023]取上述PCR扩增产物两份，每份5μl，分别加入两种检测探针各1.5pmol,补充杂交缓冲液至终体积30μl，混匀，95℃变性10min，冷却至50℃，取20μl加入到链霉亲和素包被(4mg/L，4℃包被过夜)的发光管中，补充杂交缓冲液至终体积200μl，48℃温育40min，倾去杂交缓冲液，用洗涤缓冲液(PBS)于48℃及室温各洗涤两次，然后加入200μl抗
‑
地高辛
‑
过氧化物酶复合物，25℃温育40min，PBS洗涤5次，加入2004发光检测底物，静置2min,用超弱发光检测仪测定6s发光积分值，同时测定空白管，
[0024]甲基化百分率＝R/(Rm+Ru)X100％；
[0025]Rm：甲基化PCR产物的相对发值；R：非甲基化PCR产物的相对发值。
[0026]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0027]本专利技术中，通过用RT
‑
PCR检测瘤细胞P16基因的表达，肿瘤细胞在用5
‑
Aza
‑
CdR处理后比处理前P16基因表达有了显著升高，甲基化程度的高低与转录产物呈明显的逆相关，同时形态学观察上也发现用5
‑
Aza
‑
CdR处理后通过脱甲基化使细胞增殖明显减缓，倍增时间明显延长，使肿瘤转移基因检测的检测效果更好。
具体实施方式
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，细胞培养及脱甲基化处理；S2，肿瘤细胞的形态学观察；S3，基因组DNA的亚硫酸氢盐的修饰；S4，甲基化特异性PCR(MSP)；S5，RT
‑
PCR检测基因表达水水平；S6，化学发光法定量检测肿瘤细胞脱甲基化处理前后基因甲基化程度；S7，利用凝胶成像分析系统对RT
‑
PCR结果进行检测图像分析。2.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法，其特征在于，所述S1用含10％小牛血清培养液37℃、5％CO2培养癌细胞株，取约3x105个细胞置入直径为100mm的培养皿中用去甲基化试剂处理(终浓度为10
‑6M)，24小时后更换培养液，以后每3天更换一次培养液，9天后收获细胞，用Trizol总RNA提取试剂盒提取DNA和RNA，以甲醛凝胶电泳和A
260
/A
280
比值判断提取RNA的完整性及纯度。3.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法，其特征在于，所述S2用倒置显微镜对5
‑
Aza
‑
CdR处理前后的肿瘤细胞观察。4.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法，其特征在于，所述S3取1～2ug基因组DNA，加入双蒸水至50μl，用NaOH(终浓度为0.2mol/L)37℃变性10min，向变性后的DNA中加入520μl新鲜配制的亚硫酸氧钠(pH5.0)和30μl新鲜配制的氢上面覆盖石蜡油，50℃水浴16h，修饰后的DNA用Wizard DNA纯化试剂盒纯化溶解于50μl的双蒸水中，再加入NaOH(终浓度0.3mol/L)室温下放置5min，最后用乙醇沉淀DNA，并以适量的双蒸水重新溶解经亚硫酸氢钠修饰过的DNA，
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20℃贮存备用。5.根据权利要求1所述的一种基于转录组的肿瘤转移基因检测方法，其特征在于，所述S4单链DNA的胞嘧啶可被亚硫酸氢盐脱氨基转变为尿嘧啶，而5
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甲基胞嘧啶则不能被修饰，仍保持为5
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甲基胞嘧啶，根据5
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甲基胞嘧啶与胞嘧啶修饰后的不同，设计甲基化和非甲基化等位基因特异的引物，PCR扩增，2％的琼脂糖凝胶电泳检测；PCR反应:反应总体积50μl,包括经亚硫酸氢钠修饰后的模板DNA约50ng，引物各300ng,dNT1.25mmol/L，1.25μlDNA聚合酶，缓冲液(16.6mmol/L硫酸铵、67mmol...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈琰，郭飞飞，康灿昆，陈志宏，
申请(专利权)人：厦门飞朔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：