利用PCR‑RFLP检测绵羊PCNP基因单核苷酸多态性的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种利用PCR‑RFLP检测绵羊PCNP基因单核苷酸多态性的方法及其应用：以待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊PCNP基因片段；用限制性内切酶SPhI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定绵羊PCNP基因第5019位的碱基多态性。由于该碱基突变位点与绵羊繁殖性状产羔数密切关联，所以该方法是一种在DNA水平上检测与绵羊生长性状密切相关分子遗传标记的方法，可以用于绵羊的辅助选择和分子育种，加快绵羊良种繁育速度。

【技术实现步骤摘要】
利用PCR-RFLP检测绵羊PCNP基因单核苷酸多态性的方法及其应用
本专利技术属于分子遗传学领域，涉及以绵羊的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及绵羊PCNP基因的单核苷酸多态性及其检测方法。
技术介绍
在绵羊育种中，人们期望通过对繁殖性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。分子育种，即分子标记辅助选择育种(MolecularMark-AssistSelection,MAS)，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90％以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于1％的此种变异被称为突变，而只有频率大于1％时才被称为单核苷酸多态性。它的变异形式有：颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下3类：基因编码区单核苷酸多态性(Coding-regionSNPs,cSNPs)、基因周边单核苷酸多态性(PerigenicSNPs,pSNPs)以及基因间单核苷酸多态性(IntergenicSNPs,iSNPs)。研究表明，位于编码区内的cSNP比较少。基因编码区内的cSNP又可分为2种：一种是编码区内的同义cSNP(SynonymouscSNP)，即SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义cSNP(Non-SynonymouscSNP)，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、聚合酶链反应—单链构象多态(PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism，PCR-SSCP)与DNA测序结合法、等位特异性PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(RestrictionFragmentLengthPolymorphism-PolymeraseChainReaction，RFLP-PCR)方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后设计上下游引物用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。PCNP(PEST-containingnuclearprotein)是一类定位于细胞核并含有PEST序列(即富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)四种氨基酸的蛋白。通过比对多个物种的序列发现，PCNP基因核酸序列的同源性较高，尤其在哺乳动物中均达到94％以上，都比较保守，说明在生物体中该蛋白应具有重要的作用及功能。在人类基因组中PCNP基因被定位在3q12.3，编码178个氨基，对其理化性质进行分析后显示其是由18种氨基酸组成的一种半衰期较短且不稳定的亲水性蛋白。PCNP很可能在细胞周期调控与肿瘤发生过程中发挥作用，编码PCNP的基因所在的3号染色体含有趋化因子受体(CKR)基因簇和多种人类癌症相关基因位点，关键肿瘤抑制基因如凋亡调控因子RASSF1、细胞移调控因子HYAL1、血管生成抑制因子SEMA3B也都在3号染色体，马凡综合征、卟啉症、VonHippel-Lindau综合症、成骨不全症等遗传病也与3号染色体相关。国内外目前关于PCNP的研究还比较少。朱江木研究发现PCNP的过表达能显著促进小鼠骨骼肌细胞C2C12细胞生长，PCNP可能参与了肌细胞的周期调控，对肌细胞生长有调控作用，对肌细胞的功能也有影响。孙颖川研究发现在类风湿关节炎患者外周血中PCNP在基因水平和蛋白水平的表达增高，类风湿关节炎病情的轻重与PCNP的表达量正相关。在类风湿关节炎的发病中，该基因的表达变化和病人的病情密切相关，PCNP有可能成为临床诊断类风湿关节炎的检测指标，也可作为疾病病情发展、预后的参考指标，亦可能是潜在的分子治疗靶点。通过mRNA差异显示技术获得属于PCNP基因的表达量差异片段GW360093，在不同繁殖力山羊的卵巢组织中存在表达量差异，真正影响山羊繁殖性状差异的是该基因表达产物的多少。PCNP在绵羊上被准确定位到1号染色体上，包括5个外显子。Genomic的登录号(NC_019458.1)，predictedmRNA登录号XM_012189341.1，mRNA全长为712bp，该基因的CDS序列全长为537bp(7-543)，可以编码179个氨基酸。针对绵羊PCNP的研究还很少，国内外鲜见报道。2013年河北农业大学邢增喜成功的克隆了山羊PCNP基因的启动子并预测了其核心调控区，为研究PCNP基因的转录调控机制奠定基础。关于动物PCNP基因遗传变异的研究国内外多见于人、鼠、猪等动物，而未有绵羊PCNP基因遗传变异或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用PCR‑RFLP检测绵羊PCNP基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊PCNP基因片段；用限制性内切酶SPhI酶切PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定绵羊PCNP基因上单核苷酸多态性位点的基因型；所述的引物对P为：上游引物：5’‑AGAATAGCATGGGCAGAA‑3’；下游引物：5’‑TCATTTCTGTGGGACACC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种利用PCR-RFLP检测绵羊PCNP基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待测绵羊全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增绵羊PCNP基因片段；用限制性内切酶SPhI酶切PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定绵羊PCNP基因上单核苷酸多态性位点的基因型；所述的引物对P为：上游引物：5’-AGAATAGCATGGGCAGAA-3’；下游引物：5’-TCATTTCTGTGGGACACC-3’。2.如权利要求1所述的利用PCR-RFLP检测绵羊PCNP基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55.3℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min。3.如权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：乐祥鹏，曹学涛，孙武，李发弟，王维民，李万宏，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62