用于定量和/或半定量突变检测方法的组合物技术

本发明专利技术涉及可以用作定量和/或半定量检测方法，具体地，数字PCR或下一代测序测定的对照和/或参考的组合物。本发明专利技术还描述了合成核酸构建体，具体地，存在于所述组合物中的质粒、试剂盒、它们的用途以及涉及根据本发明专利技术所述的组合物的用途的方法。此外，本文描述了用于提供根据本发明专利技术所述的组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及可以用作定量和/或半定量突变检测方法，具体地，数字PCR或下一代测序方法的对照和/或参考的组合物。本专利技术还描述了合成核酸构建体，具体地，存在于所述组合物中的质粒、包含所述组合物的试剂盒、它们的用途以及涉及使用根据本专利技术所述的组合物的方法。此外，本文描述了用于提供根据本专利技术所述的组合物的方法。
技术介绍
核酸序列的使用已成为现代医学的多种诊断领域中的必需工具。具体地，基于下一代测序(NGS)的基因测试正迅速在临床诊断学中获得认可。该领域的实例为肿瘤学，其中使用核酸测序来鉴定(例如)致癌突变是否存在于基因中或者引起和/或指明癌症的移位是否存在于基因组中。此外，使用核酸测序来检测病原微生物(如，例如，细菌或病毒)是否存在于来自人患者的临床样品，例如，组织样品或血液样品中。在后一种方法中，检测不存在于人受试者中，而仅存在于微生物中的核酸序列。因此，NGS方法可以导致靶标序列的鉴定和序列确定，其可以表明致癌突变的存在或不存在或者病原体-来源的核酸的存在或不存在。因此，目前开发了用于诊断目的的基于NGS技术及其它定量和/或半定量突变检测方法的诊断试剂盒和/或方法。然而，由于管理性规定，在许多国家，在实际产品许可进入市场之前，必须显示这类诊断试剂盒和方法的准确度和有用性(例如，通过达到特定灵敏度阈值)。在该背景下，通常需要显示所使用的方法适合检测稀有突变或稀有核酸，例如，以5％或以下的频率在临床样品中发生的突变或核酸。另外，为了确保已正确进行诊断方法，由此避免任何假阴性结果，还必须提供具有如通常在临床样品中处于类似的低频率的待检测的突变或核酸的阳性对照。然而，对于稀有突变(如在某些类型癌症中存在的突变)或对于以低百分比存在于样品中的核酸(例如，来源于病原体的核酸)，很难获得可以用作测试材料的携带处于所需频率的待检测的突变和/或核酸的临床样品。因此，需要包含处于所需频率的待检测的稀有突变和/或核酸的参考组合物和/或对照组合物。
技术实现思路
因此，本专利技术的目标是提供这种参考和/或对照组合物。在本专利技术的背景中，现已意外地发现组合物以限定的摩尔比包含(i)合成核酸构建体，具体地，包含至少一种插入的野生型核酸序列的质粒或(ii)基因组DNA和(iii)合成核酸构建体，具体地，包含至少一种插入的靶标核酸序列的质粒，所述组合物可以用作用于半定量和/或定量方法(如NGS或数字PCR)的这种参考和/或对照组合物。通过使用本专利技术所述的组合物，不再需要使用可能难以获得并且其中所存在的待检测的突变或核酸的频率可能不同的临床样品。此外，本专利技术所述的组合物提供了以下优势：可以提供它们用于任何所需的待检测突变或核酸或待检测突变或核酸的组合以及用于任何所需百分比的待检测突变或核酸。在以下说明中，提及了存在于根据本专利技术所述的组合物中的质粒(i)和(iii)。然而，应理解当然在本专利技术的背景中还可以使用能够包含野生型靶标序列或其突变体或者任何其它序列(如来源于病原体的序列)中任一种的任何其它合成核酸构建体。因此，在一个方面，本专利技术涉及组合物，其包含：(i)含有至少一种插入的野生型核酸序列的质粒，或(ii)野生型基因组DNA序列，与限定的摩尔比的(iii)含有至少一个插入的靶标核酸序列的质粒。一个实施方式涉及所述组合物，其中所述质粒(iii)包含1-50个插入的靶标核酸序列。在另一个实施方式中，质粒(iii)包含1-30个插入的靶标核酸序列。在其它实施方式中，质粒(iii)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个插入的靶标核酸序列。在另一个实施方式中，(iii)和(i)或(ii)的限定的摩尔比在1:10-1:30的范围内，任选地，(iii)和(i)或(ii)的限定的摩尔比为1：15至1:25，例如，1:20、1:18，任选地，1:19。在另一个实施方式中，所述组合物为用于定量和/或半定量突变检测方法的阳性对照组合物或参考组合物。在一个实施方式中，所述定量和/或半定量突变检测方法为数字PCR和/或下一代测序(NGS)。本专利技术的另一个方面涉及在定量和/或半定量突变检测方法中如本文所述的组合物作为对照组合物和/或参考组合物的使用。在一个实施方式中，将所述组合物用作阳性对照组合物。在另一个方面，将所述组合物用于测试定量和/或半定量突变检测方法的灵敏度。在另一个实施方式中，将确认对于平均以10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％存在于样品中的一个或多个靶标序列的灵敏度。在其它实施方式中，所述突变检测方法为数字PCR和/或下一代测序(NGS)。在另一个实施方式中，所述定量和/或半定量突变检测方法用于来源于病原体或致癌基因的序列的存在与否的检测。本专利技术的其它方面涉及确认半定量和/或定量检测方法对于一个或多个靶标序列的灵敏度的方法，其包括以下步骤：(i)提供如本文所述的组合物，(ii)使用所述组合物实施所述半定量和/或定量检测方法，和(iii)评价所述检测方法的灵敏度。本专利技术的另一个方面涉及制备如本文所述的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)将野生型序列引入到质粒中或提供野生型基因组DNA(gDNA)，(ii)将至少一个靶标序列引入到单独的质粒中，(iii)所述质粒和/或gDNA的绝对定量(iv)以限定的摩尔比制备(i)和(ii)的组合物。在用于制备如本文所述的组合物的方法的一个实施方式中，通过数字PCR(dPCR)，任选地通过数字微滴式PCR(ddPCR)进行所述质粒或gDNA的绝对定量。本专利技术的另一个方面涉及包含如本文所述的组合物的试剂盒。附图说明图1显示了制备作为如以下所述的实施例中所使用的NGS测定的测试材料的质粒组合物的列表。定义除非上下文中明确规定，否则如本说明书和权利要求中所使用的，单数形式的“一个”也包括相应的复数形式。反之亦然，当使用名词的复数形式时，除非上下文明确表明，否则它还表示单数形式。例如，当提及复数的突变时，还理解为涉及单个突变。需要理解术语“包括”不是限制性的。出于本专利技术的目的，术语“由…组成”应认为是术语“包括”的优选实施方式。如果在下文中将组定义为包括至少某些实施方式，则这还意味着涵盖了优选地仅由这些实施方式组成的组。此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三或(i)、(ii)、(iii)等用于区别类似的元素并且不必须用于描述顺序或依时间次序。应理解在适当的情况下，如此使用的术语是可互换的，并且本文所述的本专利技术的实施方式能够以本文所述或所示的顺序以外的顺序进行。然而，在本专利技术的具体实施方式中，依时间次序进行方法步骤(i)、(ii)和(iii)，其任选地包括本文定义的任何中间步骤。在本专利技术的背景中，所表示的任何数值通常与本领域技术人员将理解的仍确保所讨论的特征的技术效果的准确度间隔有关。如本文所使用的，与所示数值的偏差在±10％的范围内，并且优选地，±5％的范围内。还通过本文所使用的术语“约”和“大约”相对于数值表明了上述与所示±10％，并且优选地±5％的数值间隔的偏差。在本专利技术的背景中，术语“核酸”是指处于单链或双链形式的天本文档来自技高网...

【技术保护点】
组合物，其包含：(i)包含至少一种插入的野生型核酸序列的合成核酸构建体，任选是质粒，其，或(ii)野生型基因组DNA序列与限定的摩尔比的(iii)包含至少一种插入的靶标核酸序列的合成核酸构建体，任选地，质粒。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.30 GB 1411603.21.组合物，其包含：(i)包含至少一种插入的野生型核酸序列的合成核酸构建体，任选是质粒，其，或(ii)野生型基因组DNA序列与限定的摩尔比的(iii)包含至少一种插入的靶标核酸序列的合成核酸构建体，任选地，质粒。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述合成核酸构建体，任选地质粒(iii)包含1-50个插入的靶标序列，任选地合成核酸构建体，任选地质粒(iii)包含1-30个插入的靶标序列。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述合成核酸构建体，任选地质粒(iii)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个插入的靶标序列。4.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中(iii)与(i)或(ii)限定的摩尔比在1:10-1:30的范围内，任选地(iii)与(i)或(ii)的摩尔比为1:19。5.根据以上权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物为用于定量和/或半定量突变检测方法的阳性对照组合物或参考组合物。6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述定量和/或半定量突变检测方法为数字PCR和/或下一代测序(NGS)。7.根据以上权利要求中任一项所述的组合物在定量和/或半定量突变检测方法中作为对照组合物和/或作为参考组合物的用途，任选地...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴梦楚，阿西尼·史密诺夫，
申请(专利权)人：贝拉医疗新加坡私人贸易有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG