本发明专利技术涉及用于使用下一代测序、特别是离子半导体测序测定样品、例如临床样品中存在的病原体的基因型的方法。本发明专利技术还涉及包含用于实施本文公开的基因分型方法的计算机单元以及适合于执行本文公开的方法的软件产品的装置。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及用于使用下一代测序、特别是离子半导体测序测定样品、例如临床样品中鉴定的基因型的方法。本专利技术还涉及包含用于实施本文公开的基因分型方法的计算机单元的装置以及适合于执行本文公开的方法的软件产品。背景许多病原体与大量个人痛苦和重要的社会-经济后果诸如医疗费用等相关。病原体诸如细菌和病毒经常作为不同的株系、基因型或亚型存在。个体株系、基因型或亚型可以或多或少易受可用治疗例如抗生素或抗病毒药物影响。近年来，抗生素耐受细菌的发展和未受或较少受已知抗病毒药物影响的病毒的发展是主要关注来源。例如，渐增数目的无法用过去足够有效的抗生素治疗的金黄色葡萄球菌菌株、结核分支杆菌菌株等被以下匹配：较高数目的死亡率和相关的社会-经济后果，例如，数天住院治疗、从感染恢复所需天数的总体增加。此外，人的重要病毒病原体，例如HIV、HCV和HBV，也值得较高注意，这是由于目前已知的抗病毒药物，例如γ干扰素、抗逆转录病毒药物等未充分消除病毒变体的发展。这些病毒具有可改变药物结合位点、从而赋予针对已知药物的部分或完全抗性的基因突变的高比率。这导致具有对于受害个体和社会两者的后果的受影响患者中的耐受病原体的较高滴度。对于社会-经济重要和已知发展引起针对一些抗病毒药物的耐受性的突变的病毒一个实例是丙型肝炎病毒(HCV)。该病毒是说明本专利技术的一个实例。HCV涉及黄病毒科含RNA病毒家族，并引起具有肝硬化和肝癌的最常见并发症的感染过程(CDC Report N°61；Younossi Z,Kallman J,Kincaid J.The effects of HCV infection and management on health-related quality of life；Hepatology.2007Mar；45(3):806-16)。在2005年，地球上估计数目超过1.7亿人受该疾病折磨(Robert-Koch-Institut:Epidemiologisches Bulletin.46/2005)，并且受影响的人数仍在上升。HCV的急性感染(所有急性肝炎感染的20％)经常导致慢性肝炎(所有慢性肝炎病例的70％)和终末期肝硬化。据估计，多达20％的HCV慢性携带者可经约20年的时间段发展肝硬化，并且每年1至4％的具有肝硬化的HCV慢性携带者处于发展肝癌的风险中(Shiffman 1999；Lauer和Walker 2001)。增加HCV引起的终末期肝病的寿命的一个选项是肝移植(全世界所有肝移植中的30％是由于HCV-感染)。此外，当肝移植不适应或不可行时，当代广泛的HCV治疗的趋势是使用联合疗法，其包括共同注射大剂量的干扰素与含有常见抗病毒制剂和一种或两种HCV复制抑制剂(特定蛋白酶-解旋酶和/或RNA聚合酶抑制剂)两者的鸡尾酒混合物(例如，Toniutto P,Fabris C,Bitetto D,Fomasiere E,Rapetti R,Pirisi M.Valopicitabine dihydrochloride；a specific polymerase inhibitor of Hepatitis C virus.Curr Opin Investig Drugs.2007Feb；8(2):150-8；)。这些鸡尾酒混合物增加恢复的百分比，然而不可避免地导致适应性的抑制剂耐受的HCV突变体的形成。HCV具有高突变率，这被认为帮助病毒逃脱其宿主的免疫系统。高突变率反映于受感染的个体中被称为准种的许多不同的HCV基因组序列的存在(Bukh等人1995；Farci等人1997)。准种由病毒编码的NS5B RNA依赖的RNA聚合酶的活性所导致，所述NS5B RNA依赖的RNA聚合酶，由于其缺乏校对功能，固有地是低保真酶。准种的可能生物后果包括：(i)发展对体液免疫和细胞免疫的逃逸突变体，导致持续性感染的建立；(ii)可变细胞嗜性(例如，嗜淋巴细胞vs嗜肝)；(iii)疫苗失败，和(iv)快速发展耐药性。因此，HCV样本的基因型和亚型的鉴定对于检测治疗反应、评估抗病毒疗法的持续时间和效力和建立病毒传播的途径的目的具有显著重要性。取决于亚型的基因型，患者目前用基于干扰素的药物(其可用于治疗基因型2、3、5和6的感染)治疗，而基因型1和4对基于干扰素的治疗不那么响应。现在公认，HCV在不同HCV分离株间作为独特基因型存在，其中每种基因型流行于特定地理位置。目前，HCV变体主要分为6种基因型，代表由核心/E1和NS5B亚基因组序列以及完整基因组序列的系统发育分析定义的6种基因组。在每种基因型内，HCV变体可进一步分为亚型(Simmonds等人.1994)。HCV基因型的命名法的当前统一系统的概述由Simmonds等人(2005)给出。用当前标准FDA批准的与利巴韦林组合的聚乙二醇化干扰素α的抗病毒疗法，仅约一半对于该治疗合格的基因型-1HCV感染的个体实现持续的病毒学响应(Manns等人，2001)。因为严重的副作用和其它医疗并发症，目前从治疗排除多达75％的HCV患者。因此，目前正在开发和早期临床试验中的新的抗HCV药物目的在于采用新的目标，诸如HCV内部核糖体进入位点(IRES)、HCV NS3丝氨酸蛋白酶和HCV NS5B RNA依赖的RNA聚合酶(参见例如Tan等人2002；De Francesco等人2003)。然而，预期HCV的高突变率和变异性有利于耐药性的出现，限制了这些抑制剂的临床有用性。事实上，已经在体外实验和初始临床试验过程中发现耐药性突变。例如，HCV亚基因组复制子已经用于研究病毒对核苷和非核苷NS5B抑制剂以及NS3/4A蛋白酶抑制剂两者的耐受性(Kukolj等人2005；Mo等人2005；综述于:Tomei等人2005)。HCV耐受性突变体的理解将朝着有效的治疗HCV进一步进展。换言之，评估现有药物耐受性突变体对不同类别的抗病毒剂的敏感性对于新药的开发至关重要。此外，探索组合治疗对耐药性的影响可以提供对未来HCV治疗策略的见解。所有这都使得能够快速开发和/或改变适当的治疗方案。因此，用适当(即，活性)药物治疗HCV-感染的患者将变得可行得多。为了跨越HCV基因型进行此类精确耐药性概况分析，需要有效地分析HCV核酸序列的方法。尽管HCV充当响应于治疗干预而进化的病原体的实例，但类似的关注也适用于变得对某些药物(例如HIV、抗生素耐受的细菌(例如MRSA)等)更加响应的其它病原体。本专利技术解决该需求以可靠和准确地确定病原体(例如病毒诸如HCV)的基因型或亚型，并提供用于使用下一代测序确定病毒基因型的新方法和装置。下一代测序是在疾病(例如感染性疾病诸如病毒感染)的诊断中变得越来越重要的方法。下一代测序允许测定核酸(例如病毒核酸)的序列，并且为医师当选择用于个体的正确治疗时提供重要信息。下一代测序基于巨量(例如，数千或数百万)序列的同时并行测序。目前，使用各种类型的下一代测序方法，Roche的454焦磷酸测序、Illumina测序、SOLiD测序和离子半导体测序是最先进的测序方法。几家公司已经在市场上引入允许以自动方式进行下一代测序方法的装置。下一代测序是该领域中的技术专家已知的，且主要基于从本文档来自技高网...
【技术保护点】
确定/检测样品中的病原体的存在或不存在和/或基因型和/或亚型的方法，所述方法包括以下步骤：a.提供怀疑含有病原体的样品，b.选择表明存在所述病原体的共有序列，c.确定选择的表明所述病原体的共有序列的核酸序列，d.使用(适合于序列比对的软件)BLAST将获得的核酸序列与表明所述病原体的已知基因序列进行比对，和e.基于选择的表明所述病原体的基因组区域的共有序列的核酸序列，确定病原体的基因型或亚型。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.06 GB 1319580.51.确定/检测样品中的病原体的存在或不存在和/或基因型和/或亚型的方法，所述方法包括以下步骤：a.提供怀疑含有病原体的样品，b.选择表明存在所述病原体的共有序列，c.确定选择的表明所述病原体的共有序列的核酸序列，d.使用(适合于序列比对的软件)BLAST将获得的核酸序列与表明所述病原体的已知基因序列进行比对，和e.基于选择的表明所述病原体的基因组区域的共有序列的核酸序列，确定病原体的基因型或亚型。2.权利要求1的方法，其进一步包括步骤f，其中确定表明所述病原体的基因序列的至少两种不同的基因型或亚型的共感染。3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述病原体是选自HCV、HIV、HBV或疱疹病毒的病毒。4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述病毒是HCV。5.权利要求1至4中任一项的方法，其中表明HCV感染的共有序列是包含核苷酸位置8614至9298的HCV NS5B基因组区域的片段。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述样品是临床样品。7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述临床样品源自选自以下的患者：a)怀疑被HCV感染的患者，b)已知被HCV感染的患者，其中HCV的基因型和/或亚型是未知的，c)先前未用抗病毒药物治疗的患者；d)已经用抗病毒药物治疗的患者，e)对抗病毒药物不响应的患者，f)被似乎对抗病毒药物耐受的HCV感染的患者，等。8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述序列通过扩增NS5B的基因组区域的部分和测定核苷酸序列来测定。9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述核苷酸序列通过下一代测序来测定。10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述序列通过测序所述共有序列和将测序信息组装成重叠群来测定。11.权利要求1至10中任一项的方法，其中使用软件算法将所述测序信息组装成重叠群序列。12.权利要求1至11中任一项的方法，其中使用适合于序列比对的软件、优选BLAST将各重叠...
【专利技术属性】
技术研发人员：普哈米拉·卢旺特·阿里亚特，李·C·华恒，
申请(专利权)人：贝拉医疗新加坡私人贸易有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG
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