本发明专利技术公开了一种基于粘性末端‑介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测UDG活性的方法，当UDG存在时，单链DNA探针中的两个U碱基被移除，得到含有AP错配的单链DNA探针。基于TSDR对少量错配的特异性识别能力，上述含AP错配的单链DNA探针将不能与含粘性末端的发夹探针发生TSDR，从而使单链DNA探针中的引物序列仍能自由存在。随后，该引物序列与信号报道探针发生杂交，进而引发后续的聚合切刻等温扩增反应，实现了对少量U碱基移除的灵敏响应，提高了检测UDG活性的灵敏度。然而，当UDG不存在时，单链DNA探针能与含粘性末端的发夹探针发生TSDR，导致引物序列被封闭，从而不能引发后续的等温扩增反应，降低了阴性信号。本方法能检测低至0.000027U/mL的UDG活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测UDG活性的方法。
技术介绍
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)能对DNA中的尿嘧啶(U)损伤进行特异地识别和移除，进而引发U损伤的碱基移除修复过程(Stivers，J.T.；Jiang，Y.L.，A mechanistic perspective on the chemistry of DNA repair glycosylases.Chem.Rev.，2003，103，2729-2759；Parikh，S.S.；Walcher，G.；Jones，G.D.；Slupphaug，G.；Krokan，H.E.；Blackburn，G.M.；Tainer，J.A.，Uracil-DNA glycosylase-DNA substrate and product structures：conformational strain promotes catalytic efficiency by coupled stereoelectronic effects.PNAS.，2000，97，5083-5088.)。人体中，每天每个细胞的基因组中会出现数百个U损伤，它们一部分来自于胞嘧啶(C)的自发水解脱氨作用，另一部分来自于DNA复制过程中三磷酸脱氧尿苷酸(dUTP)的错误掺入(Sousa，M.M.；Krokan，H.E.；Slupphaug，G.，DNA-uracil and human pathology.Mol.Aspects Med.，2007，28，276-306；Kavli，B.；Sundheim,O.；Akbari，M.；Otterlei，M.；Nilsen，H.；Skorpen,F.；Aas，P.A.；Hagen，L.；Krokan，H.E.；Slupphaug，G.，hUNG2 is the major repair enzyme for removal of uracil from U：A matches，U：G mismatches，and U in single-stranded DNA，with hSMUG1 as a broad specificity backup.J.Biol.Chem.，2002，277,39926-39936.)。异常活性的UDG将不能对这些U损伤进行修复，从而引起基因突变，干扰基因组的完整性，导致相关疾病的发生(Bulgar，A.D.；Weeks，L.D.；Miao，Y.；Yang，S.；Xu，Y.；Guo，C.；Markowitz,S.；Oleinick，N.；Gerson，S.L.；Liu,L.，Cell Death Dis.，2012，3，e252.)。因此，灵敏检测UDG的活性能为功能研究和临床诊断提供一种有价值的策略。目前检测UDG活性的常用方法需要放射性的标记或耗时的电泳过程(Ischenko，A.A.；Saparbaev，M.K.，Alternative nucleotide incision repair pathway for oxidative DNA damage.Nature，2002，415，183-187.)。为了实现安全且快速地检测UDG的活性，一些新型的生物传感方法已被发展，包括电化学生物传感法(McWilliams，M.A.；Anka，F.H.；Balkus，K.J.；Slinker，J.D.，Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair.Biosens，Bioelectron.，2014，54，541-546.)、比色生物传感法(Liu，X.J.；Chen，M.Q.；Hou，T.；Wang，X.Z.；Liu，S.F.；Li，F.，Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification.Biosens，Bioelectron.，2014，54，598-602.；Nie，H.；Wang，W.；Li，W.；Nie，Z.；Yao，S.，A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex.Analyst，2015，140，2771-2777.)以及荧光生物传感法(Liu，B.；Yang,X.；Wang，K.；Tan,W.；Li，H.；Tang，H.，Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes.Anal.Biochem.，2007，366，237-243.)。其中，荧光生物传感法已被广泛用于检测UDG的活性。为了进一步提高检测的灵敏度，信号扩增技术已被用于荧光生物传感方法的构建中。Yu课题组(Zhang，L.L.；Zhao，J.J.；Jiang，J.H.；Yu，R.Q.，A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity.Chem.Commun.，2012,48,8820-8822.)设计了一种含有多个U碱基的双链DNA探针，当UDG将该双链DNA探针中的多个U碱基移除之后，双链DNA发生解离并释放出DNA酶序列，从而引发DNA酶的自催化信号扩增过程。申请号为CN201510061929.X的专利公开了一种基于DNA机器的荧光信号扩增方法用于UDG的活性检测，其中DNA机器的引发部分也是一种含有多个U碱基的双链DNA探针，并且只有当该双链DNA探针中的多个U碱基都被UDG移除之后，它才能释放出引物序列来引发DNA机器的运行。在这些信号扩增型的荧光生物传感方法中，它们通过直接杂交模式将信号探针或引物序列封闭在双链DNA中，并把这种含多个U碱基的双链DNA作为UDG的识别探针。然而，当低活性的UDG只能移除探针中的1个或2个U碱基而产生少量无嘌呤/无嘧啶位点(AP)位点时，由于AP位点也是一种错配类型，而直接杂交模式难以辨别少量错配，因此信号探针或引物序列此时仍被封闭在双链DNA中，导致响应减弱，限制了灵敏度的提高。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种检测UDG活性的探针，目的之二是提供一种基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术检测UDG活性的方法，目的之三是提供一种检测UDG活性的试剂盒。具体技术方案如下：一种检测UDG活性的探针，包括单链DNA识别探针U本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测UDG活性的探针，包括单链DNA识别探针UP、发夹探针TP以及信号报道探针RP；所述单链DNA识别探针包括：引物序列、1个或两个连续的U碱基，所述两个连续的U碱基在单链DNA的端部；所述发夹探针TP包括，粘性末端、与识别探针UP完全互补的颈部碱基序列；所述信号报道探针RP，是一种发夹结构，3’端含有悬垂的序列，所述悬垂序列能够与识别探针UP序列杂交，颈部含有G4DNA的互补序列和切刻酶Nt.BstNBI的识别序列。
【技术特征摘要】
1.一种检测UDG活性的探针，包括单链DNA识别探针UP、发夹探针TP以及信号报道探针RP；所述单链DNA识别探针包括：引物序列、1个或两个连续的U碱基，所述两个连续的U碱基在单链DNA的端部；所述发夹探针TP包括，粘性末端、与识别探针UP完全互补的颈部碱基序列；所述信号报道探针RP，是一种发夹结构，3’端含有悬垂的序列，所述悬垂序列能够与识别探针UP序列杂交，颈部含有G4DNA的互补序列和切刻酶Nt.BstNBI的识别序列。2.一种检测UDG活性的方法，基于粘性末端-介导的链置换反应结合聚合切刻等温扩增技术，其特征是：步骤如下：(1)将发夹探针TP以及信号报道探针RP加热变性降温后备用；(2)对UDG的识别反应：将识别探针UP与待测的UDG加入到1×ThermoPol缓冲溶液中进行孵育反应，；(3)TSDR对产物AP错配的特异性识别：向步骤(2)的反应产物中加入发夹探针TP和10×ThermoPol缓冲溶液进行孵育反应；(4)聚合切刻等温扩增反应：向步骤(3)反应产物中加入1×ThermoPol缓冲溶液，NEB buffer 3，dNTPs，信号报道探针RP，Vent(exo-)DNA聚合酶以及Nt.BstNBI切刻酶混合反应；(5)向步骤(4)反应产物中加入KCl溶液，NMM溶液，混合反应，对反应产物进行荧光测定，构建荧光强度与UDG浓度之间的线性曲线，对某一样品通过测定样品的荧光强度，代入线性曲线，计算UDG浓度；所述识别探...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，王磊，吴玉姝，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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