基于颜色判定的环介导等温扩增（LAMP）技术检测雪松疫霉根腐病菌制造技术

本发明专利技术公开了一种基于颜色判定的环介导等温扩增（LAMP）技术检测雪松疫霉根腐病菌的分子检测方法及其引物，引物序列分别如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示。本发明专利技术的检测体系在62°C等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到雪松疫霉根腐病菌，且不需要复杂仪器，为雪松疫霉根腐病菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足对雪松疫霉根腐病菌的现场检测，适用于出入境植物和植物产品的检验检疫和病害的调查、快速诊断及监测等，对防止雪松疫霉根腐病菌传入我国具有重要意义，同时，本发明专利技术体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。

Ring mediated isothermal amplification (LAMP) technique for detection of Phytophthora root rot pathogens based on color determination

The invention discloses a loop mediated isothermal amplification based on color decision guide (LAMP) molecular detection technology of cedar Phytophthora root rot detection methods and primers, primer sequences respectively, such as SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.5 shown. The invention of the detection system in the 62 ~ C under isothermal condition, fast, convenient, efficient, high specificity and high sensitivity detection to cedar Phytophthora root rot, and does not require complex equipment and supplies a new technology platform for the detection of cedar Phytophthora root rot, which can better meet the on-site detection of loose snow phytophthora root rot disease, and is suitable for inspection and Quarantine of entry-exit plants and plant products investigation, rapid diagnosis and monitoring, and to prevent cedar Phytophthora root rot was introduced to China is of great significance, and provide technical guidance and theoretical basis for the establishment of the system for other pathogenic bacteria detection.

【技术实现步骤摘要】
基于颜色判定的环介导等温扩增(LAMP)技术检测雪松疫霉根腐病菌
本专利技术涉及一种检测雪松疫霉根腐病菌(PhytophthoralateralisTuckeretMibrath)的LAMP引物，以及利用所述引物检测雪松疫霉根腐病菌的分子检测方法，属于生物

技术介绍
雪松疫霉根腐病菌是一用于种重要的毁灭性植物病原菌，可侵染美国扁柏Chamaecyparislawsoniana(A.Murraybis)Parlatore引起严重的根腐病。病害最早于1923年在美国西雅图、华盛顿附近的观赏植物上有报道发生，直到1942年，病菌在美国俄勒冈州的威拉梅特谷被发现并命名，病菌造成俄勒冈州西北部和华盛顿西部观赏植物的严重经济损失，使极具价值的园艺栽培种几乎全部毁灭，随后病菌传入加拿大、法国，对当地观赏植物及林业贸易造成严重影响[1]。由于该病害为害重、传播快，而防治根除又极为困难，该病原菌已引起欧盟等许多国家的高度重视，纷纷采取措施严防其传入。近年来，由于国际间苗木及其植物包装材料的调运日趋频繁，该病原菌极可能传入我国，一旦传入，将对我国农林业、生态环境等造成重大威胁。由于我国未有雪松疫霉根腐病菌发生的报道，国家质检总局于2007年将该病菌列入新修订的《进境植物检疫性有害生物名录》中。为了防止该病原菌传入我国，需要对其进行快速、准确地检测，因此针对雪松疫霉根腐病菌的检测我们进行了一系列的研究。雪松疫霉根腐病菌(PhytophthoralateralisTucker&Milbrath)又名侧生疫霉，隶属藻菌界(Chromista)，卵菌门(Oomycota)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科(Pythiaceae)，疫霉属(Phytophthora)，是一类重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范围均很广泛。病菌在V8培养基上生长速度较慢(2mm/d～4mm/d)，菌落平贴至中度的蓬松。最低生长温度为3℃，最适生长温度20℃，最高生长温度26℃。菌丝无隔、分枝多而短，无色，常见的是光滑的，偶尔也有粗糙的，长时间培养后会在培养基上形成一层薄膜。可产生菌丝膨大体，最终形成厚垣孢子，厚垣孢子棕褐色，直径22μm～77μm，平均40μm，无柄，单个生于孢子梗顶端。病菌孢子囊无乳突，丛生于孢囊梗上，卵圆形、倒卵形、倒梨形，20μm～60μm×12μm～20μm(平均26μm×15μm)，长宽比1.67～5:1，平均1.73:1，游动孢子有侧生双鞭毛，直径为10μm～12μm。病菌为同宗配合，雄器侧生，藏卵器球形、光滑，卵孢子满器、壁厚约6μm，直径28μm～46μm，平均40μm[1]。传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等，操作繁琐，耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰[2]，随着分子生物学的发展，分子生物学技术已逐步应用到雪松疫霉根腐病菌的研究中。基于普通PCR的方法已经成功用于检测雪松疫霉根腐病菌[3,4]，虽然普通PCR法在特异性和灵敏度上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时普通PCR方法依赖精密的温度循环装置，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是日本的荣研株式会专利技术的一种新的核酸扩增技术[5]，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代普通PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60～70min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生[6]。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。目前，分子检测常用的靶标基因有核糖体基因转录间隔区(Internaltranscribedspace,ITS)，然而许多学者认为该靶标没有足够的变异位点区分所有的疫霉种[7]。本专利技术选用的新型靶标三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)是一个与原癌基因Ras(Ratsarcoma)相关的基因，在酵母中，该基因编码一个与Ras相关的GTP结合蛋白。Ypt1基因包含有多个内含子，非编码区具有足够多的特异性位点，并且其序列在种内高度保守，非常适合作为疫霉菌的分子检测靶标[8]。参考文文献如下：1.Erwin,D.C.；Ribeiro,O.K.Phytophthoralateralis.In:Phytophthoradiseasesworldwide.AmericanPhytopathologicalSociety,St.Paul(US),1996,pp365-367.2.DaniellsJ,DavisD,PetersonR,etal..Goldfinger:notasresistanttosigatoka/yellowsigatokaasfirstthought.Infomusa，1995,4(1):6.3.Winton,L.M.；Hansen,E.M.MoleculardiagnosisofPhytophthoralateralisintrees,water,andfoliagebaitsusingmultiplexpolymerasechainreaction.ForestPathology,2001,31(5):275-283.4.纪睿,王健生,廖太林,李百胜,张正光,郑小波.雪松疫霉(Phytophthoralateralis)的快速分子检测.植物病理学报,2014,44(2):113-120.5.Notomi,T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,Yonekawa,T.,Watanabe,K.,Amino,N.,andHase,T.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsResearch,2000,28:e63-e63.6.6.YasuyoshiMori,KentaroNagamine,NorihiroTomita,andTsugunoriNotomi.DetectionofLoop-MediatedIsothermalAmplificationReactionbyTurbidityDerivedfromMagnesiumPyrophosphateFormation.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2001,289:e150-e154.7.White,T.J.,Bruns,T.,Lee,S.,andTaylor,J.AmplificationanddirectsequencingoffungalribosomalRNAgenesforphylogenetics.1990,Pages315-322in:PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测雪松疫霉根腐病菌的LAMP引物，其特征在于：其包括四条特异性引物F3、B3、FIP、BIP和一条环引物LB，引物序列分别如SEQ ID NO. 1至 SEQ ID NO. 5所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测雪松疫霉根腐病菌的LAMP引物，其特征在于：其包括四条特异性引物F3、B3、FIP、BIP和一条环引物LB，引物序列分别如SEQIDNO.1至SEQIDNO.5所示。2.一种基于颜色判定的雪松疫霉根腐病菌的LAMP检测方法，其特征在于：提取待测样品的DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行LAMP扩增反应，反应后，在常光下肉眼观察，以羟基萘酚蓝的颜色变化进行结果判定；常光下，天蓝色表示检测结果为阳性，即样品中检测到雪松疫霉根腐病菌，紫色表示检测结果为阴性，即样品中未检测到雪松疫霉根腐病菌。3.根据权利要求2所述的LAMP检测方法，其特征在于：其LAMP扩增反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪睿，曾丹丹，廖太林，郑小波，张正光，周锐，吴军，
申请(专利权)人：中华人民共和国昆山出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：江苏,32