黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物及其应用。一种基于LAMP技术检测黄瓜炭疽病菌的引物组合物由4条特异性引物F3、B3、FIP、BIP组成。本发明专利技术还提供了一种黄瓜炭疽菌LAMP检测方法，包括以下步骤：1）提取待测样品DNA；2）使用本发明专利技术提供的引物组合物对待测样品DNA进行环介导等温扩增；3）结果检测，显色结果观察到绿色荧光或电泳出现梯形条带的判断为阳性，显色橙色（橘黄色）或没出现梯形条带的判断为阴性。本发明专利技术为黄瓜炭疽病菌提供了新的分子检测方法及引物组合物，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到黄瓜炭疽病菌，为防治黄瓜炭疽病提供可靠的技术和理论依据。

【技术实现步骤摘要】
黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物及其应用
本专利技术属于农作物病害检测、鉴定及防治
，具体涉及一种黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物及其应用。可用于黄瓜炭疽病菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于黄瓜炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。
技术介绍
黄瓜（CucumissativusL.）营养丰富，气味清香，鲜食、熟食均可，是深受广大生产者和消费者喜爱的高经济价值蔬菜作物。黄瓜因其繁多的品种类型和其较强的生长适应性，而得到广泛的应用，因而黄瓜是全球性栽培的主要蔬菜之一。随着我国种植业结构的调整和设施农业的发展，黄瓜在中国的种植面积和复种指数不断扩大，随之黄瓜病虫害的发生也日趋严重，病虫害已成为限制黄瓜产业发展的重要因素之一。由葫芦科刺盘孢菌（Colletotrichumorbiculare）侵染引起的炭疽病是一种重要的黄瓜病害，在全国各地均有发生，主要危害黄瓜叶片、茎蔓和果实，全生育期均可发病，尤以生长后期受害最严重。该病菌侵染力强、繁殖率高，以菌丝体或拟菌核在种子上或随病残体在土壤中越冬，发病条件一旦适宜，就会造成病害的大面积流行，常造成植株中下部大量叶片干枯，果实产生病斑，降低品质或完全失去商品价值，使黄瓜产量降低，严重时病株率达100%，产量损失40%以上，甚至绝收。近年来该病的发生有不断加重的趋势，然而，针对此病尚无较好的抗病品种和特效农药可以利用，防治难度较大。因此，快速、准确地在发病前或初期对病菌的侵染动态进行监测，及时采取有效的防治方法对控制病害在田间和储运中的发生，减少经济损失具有十分重要的意义。传统炭疽病菌的分类与鉴定主要基于形态学特征及致病性测定等，这种鉴定方法耗时较长、程序繁琐、灵敏度低以及经验性强，从发病植株中分离并鉴定病原菌需要数天时间，难以做到对病害发生及时监测和有效控制病原菌的传播与病害流行。随着分子生物学技术的不断发展，应用PCR、血清免疫学等技术对病原菌进行特异和快速分子检测的成功例子已越来越多，但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处。如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性；PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和实时荧光定量PCR等，PCR技术检测时间较长，需要依靠PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备，不利于基层生产上推广应用，上述缺欠限制了这些先进方法的推广应用。环介导等温扩增（Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP）技术是由日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术，该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增。在1小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至109~1010个拷贝数。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-timePCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBRGreenⅠ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济，且无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合于在基层生产部门推广应用，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于黄瓜炭疽病菌的LAMP检测国内外均未见报道。本专利技术基于环介导等温扩增（LAMP）技术原理，选取炭疽菌Beta-tubulin基因序列为检测靶标，在Beta-tubulin基因序列的6个区域设计了4条黄瓜炭疽病菌特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，建立以SYBRGreenⅠ为荧光显色指示剂的黄瓜炭疽病菌可视化LAMP检测技术。该技术操作简单、灵敏度和特异高，且无需贵重仪器设备，适宜于田间黄瓜炭疽病的早期诊断和病原菌的检测和鉴定，对黄瓜炭疽病及时、有效的防治具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中对黄瓜炭疽病菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了一种黄瓜炭疽病菌LAMP技术检测方法及使用的引物组合物，本专利技术检测方法易于操作、特异性强、灵敏度高、结果准确可靠。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：1.黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物：通过测定黄瓜炭疽病菌（Colletotrichumorbiculare）和其它炭疽病菌（Colletotrichumspp）的Beta-tubulin基因，对炭疽菌属不同种间Beta-tubulin基因序列进行比对分析，利用在线LAMP引物设计软件PrimersoftwareExplorerV4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html;EikenChemicalCo.,Japan)设计一套黄瓜炭疽病菌特异性LAMP引物，包括F3、B3、FIP和BIP等4条引物，其序列为：F3:5’-GGGGCTAACTGCTTGAACAG-3’，B3:5’-GGTGCCGTTGTACCTGTT-3’，FIP:5’-TGTGCGAAGCATCGTTGCCGGGTAACCAGATTGGTGCTGC-3’，BIP:5’-AGGCAAAACATCTCTGGCGAGCCCATTCTTGACGTGGCCTTA-3’。2.黄瓜炭疽病菌LAMP检测方法，包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA。用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法进行提取基因组DNA，具体方法如下：取少量菌丝粉于1.5mL离心管中（菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜），加入900µL2%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）提取液（2%CTAB；100mmol/LTris-HCl,pH8.0；20mmol/LEDTA，pH8.0；1.4mol/LNaCl）和90µLSDS（十二烷基苯磺酸钠）【注：CTAB，SDS需60℃预热】，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴1h（DNA释放至缓冲液中），12000r·min-1离心15min；取上清液700µL，加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1），轻轻振荡混匀，12000r·min-1离心9min；取上清液500µL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r·min-1离心5min；取上清液350µL，加入1/10体积3mol·L-1NaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r·min-1离心5min；弃去上清液，加入700µL冰70%乙醇进行洗涤（稍离心；倾掉上清液），在超净工作台上晾干至无酒精味，加入30~60µLTE（10mmol/LTris-HCl，0.1mmol/LEDTA，pH8.0）溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至100ng/µL待用。用于检测植物组织中存在黄瓜炭疽病菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下：向每毫克植物组织中加入10µL0.5mol/LNaOH，在研钵中将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL离心管本文档来自技高网...

【技术保护点】
黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：F3: 5’‑ GGGGCTAACTGCTTGAACAG ‑3’，B3: 5’‑ GGTGCCGT TGTACCTGTT ‑3’，FIP: 5’‑ TGTGCGAAGCATCGTTGCCGGGTAACCAGATTGGTGCTGC ‑3’，BIP: 5’‑ AGGCAAAACATCTCTGGCGAGCCCATTCTTGACGTGGCCTTA ‑ 3’。

【技术特征摘要】
1.黄瓜炭疽病菌LAMP检测引物，其特征在于，其核苷酸序列为：F3:5’-GGGGCTAACTGCTTGAACAG-3’，B3:5’-GGTGCCGTTGTACCTGTT-3’，FIP:5’-TGTGCGAAGCATCGTTGCCGGGTAACCAGATTGGTGCTGC-3’，BIP:5’-AGGCAAAACATCTCTGGCGAGCCCATTCTTGACGTGGCCTTA-3’。2.一种利用权利要求1所述引物进行黄瓜炭疽病菌LAMP检测的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：（1）提取待测样品基因组DNA；（2）LAMP反应体系的建立：LAMP检测反应体系为25μL，以步骤（1）提取的DNA为模板，反应体系包括5μMF3和B3各1.0μL，40μMFIP和BIP各1.0μL，LAMP反应混合液12.5μL，8UBst聚合酶1.0μL，DNA模板1.0μL，用灭菌超纯水补足至25μL；（3）LAMP反应条件：63.5℃温育60min，85℃灭活5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰成忠，吴玮，阮宏椿，姚锦爱，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35