【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，更具体的说是涉及一种大洋臀纹粉蚧快速检测引物组、试剂盒和鉴定方法。
技术介绍
1、目前，基于形态学进行物种鉴定，是昆虫分类学中应用较为普遍的方法，但介壳虫等昆虫个体较小，肉眼难以识别，且存在近似种、亲缘种、复合种，仅依靠其形态特征难以准确鉴定。分子鉴定技术不受虫体结构及发育阶段限制，为小型昆虫的鉴定提供了许多便利。
2、但是，提取基因组dna和普通pcr、实时荧光定量等分子检测方法通常对实验室设备依赖性强、检测程序相对复杂，鉴定时间长，结果判定也需要借助成像系统或者序列比对等来进行，并不适合于野外的现场快速检测。
3、综上，如何提供一种高效、精准、简便、可视化的鉴定大洋臀纹粉蚧的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种大洋臀纹粉蚧快速检测引物组、试剂盒和鉴定方法。
2、纤维素滤纸可以快速结合核酸，并在短时间内保留已捕获核酸，通过洗涤步骤去除部分污染物。然后将核酸直接洗脱至rpa扩增溶液中恒温扩增靶标序列，crispr-cas12a依赖rna引导在靶标位点发挥核酸内切酶活性，并显现其非特异性酶切活性，与荧光报告分子/侧向流层析试纸条报告分子联用，使检测结果可视化。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、一种大洋臀纹粉蚧快速检测引物组，包括dy-rpa-f和dy-rpa-r，具体核苷酸序列如下：
5、dy-rpa-f：5’-c
6、dy-rpa-r：5’-acgagcagccaacgacgcccccgaaagaac-3’，se q id no.2。
7、一种大洋臀纹粉蚧快速检测试剂盒，包括上述的引物组。
8、进一步的，还包括crrna，所述crrna的核苷酸序列如下：
9、5’-uaauuucuacuaaguguagaucgacccgucuugaaacacgga cca-3’，seq id no.3。
10、进一步的，还包括荧光报告分子或侧向流层析试纸条报告分子。
11、进一步的，所述荧光报告分子为5′-ttatt-3′，5′标记6-fam，3′标记b hq1；
12、所述侧向流层析试纸条报告分子为5′-ttatt-3′，5′标记6-fam，3′标记biotin。
13、进一步的，还包括缓冲液rehydration buffer、mgoac、rnase-free h2o和单管酶干粉末。
14、进一步的，还包括cas12a。
15、进一步的，还包括提取缓冲液。
16、每1l提取缓冲液的配制：2.42g tris base、1.46g nacl和20g pvp-40溶解在900ml水中，加入0.73g edta和5ml质量浓度为10％的sd s，用盐酸将ph值调节到8，定容至1l。
17、进一步的，还包括清洗缓冲液。
18、每1l清洗缓冲液的配制：1.21g tris碱溶解在900ml水中，用盐酸将ph值调节到8，用水定容至1l。
19、进一步的，还包括试纸条1；
20、所述试纸条1采用滤纸制备而成。
21、进一步的，所述试纸条1的制备方法如下：
22、石蜡和染料以质量比95：0.67在热板上熔化，倒入一次性塑料培养皿中，将滤纸放入蜡中，让蜡浸渍三分之二的滤纸，随后将浸蜡滤纸放在铝箔上硬化1分钟；在距离蜡边6mm的未覆盖蜡的滤纸上画一条平行于蜡边的铅笔线，用切片机将滤纸裁切为2mm宽的试纸条(浸过蜡的滤纸可以防水，产生一个疏水区域，便于手拿；提取dna的部分为未经过蜡浸泡的滤纸部分)。
23、一种大洋臀纹粉蚧快速检测方法，使用上述的引物组或上述的试剂盒。
24、进一步的，包括如下步骤：
25、(1)dna的粗提；
26、(2)以步骤(1)得到的dna为模板，利用dy-rpa-f和dy-rpa-r进行等温扩增，得到rpa扩增产物；
27、(3)利用crrna，加入荧光报告分子或侧向流层析试纸条报告分子以及步骤(2)的rpa扩增产物，在crispr-cas12a体系中进行裂解反应，得到裂解产物；
28、(4)对裂解产物进行鉴定。
29、进一步的，所述步骤(1)的具体操作为：向待测样品中加入提取缓冲液，进行研磨，之后将试纸条1浸入研磨液，再将试纸条1浸入清洗缓冲液以纯化dna；
30、所述试纸条1采用滤纸制备而成。
31、进一步的，当步骤(3)加入荧光报告分子时，所述步骤(4)的具体操作为：将步骤(3)的裂解产物在365nm紫外光下进行显色，若裂解产物在紫外光下呈现白色光，则表示测试样品为大洋臀纹粉蚧，若裂解产物在紫外光下无荧光亮度，则表示测试样品不是大洋臀纹粉蚧；
32、当步骤(3)加入侧向流层析试纸条报告分子时，所述步骤(4)的具体操作为：将步骤(3)的裂解产物用侧向流试纸条进行检测，若检测线出现红色条带，则表示测试样品为大洋臀纹粉蚧，若检测线不出现红色条带，则表示测试样品不是大洋臀纹粉蚧。
33、进一步的，所述侧向流试纸条为cas12/13专用核酸检测试纸条，cat.no.jy0301。
34、上述的引物组、上述的试剂盒在农业生产中的应用。
35、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：
36、(1)在室温下即可提取dna，不使用水浴锅，提取时间短，高效。提取缓冲液和清洗缓冲液不使用有毒有害试剂，无需灭菌，可在室温(18～25℃)下储存至少1年。
37、(2)dna扩增在室温环境下即可进行，无需实验室大型仪器，如pcr仪。
38、(3)特异性强，并且结果可视化，无需再进行凝胶电泳成像确认条带。
39、(4)本专利技术提供的快速粗提dna方法极大缩短了dna提取时间，使用rpa技术恒温扩增靶标序列，联用crispr-cas12a技术鉴定酶切标靶序列并依赖荧光报告分子/侧向流层析试纸条报告分子使检测结果可视化，整体方法较传统方法实现了高效、精准、可视鉴定，更适合用于推广和应用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种大洋臀纹粉蚧快速检测引物组，其特征在于，包括DY-RPA-F和DY-RPA-R，具体核苷酸序列如下：
2.一种大洋臀纹粉蚧快速检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如下：
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光报告分子或侧向流层析试纸条报告分子。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告分子为5′-TT ATT-3′，5′标记6-FAM，3′标记BHQ1；
6.一种大洋臀纹粉蚧快速检测鉴定方法，其特征在于，使用权利要求1所述的引物组或权利要求2～5任一所述的试剂盒。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作为：向待测样品中加入提取缓冲液，进行研磨，之后将试纸条1浸入研磨液，再将试纸条1浸入清洗缓冲液以纯化DNA；
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，当步骤(3)加
10.权利要求1所述的引物组、权利要求2～5任一所述的试剂盒在农业生产中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种大洋臀纹粉蚧快速检测引物组，其特征在于，包括dy-rpa-f和dy-rpa-r，具体核苷酸序列如下：
2.一种大洋臀纹粉蚧快速检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括crrna，所述crrna的核苷酸序列如下：
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光报告分子或侧向流层析试纸条报告分子。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告分子为5′-tt att-3′，5′标记6-fam，3′标记bhq1；
6.一种大洋臀纹粉蚧快速检测鉴定方法，其特征在于，使用权利要求1所述的引物组或权利要求2～5任一所...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈燕婷，李建宇，史梦竹，陈彦，阮菲，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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