【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农作物病害检测、鉴定及防治，特别是涉及用于香蕉枯萎病菌4号生理小种lamp-lfd检测的引物探针组合、试剂盒和方法。
技术介绍
1、由尖孢镰刀菌古巴专化型[fusarium oxysporum f.sp.cubense(e.f.smith)snyder et hansen]侵染引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上的一种毁灭性土传病害，该病菌在中国、澳大利亚、南非和菲律宾等香蕉主产地区均有发生，严重威胁了香蕉的稳产、增产。根据香蕉枯萎病菌危害香蕉品种的不同细分为不同的生理小种，目前报道侵染香蕉造成重大损失的尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种主要有1号生理小种、2号生理小种和4号生理小种，其中4号生理小种的侵染性最强、毁灭性最大。因此，建立快速、准确检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测技术，对于防止该病害的传播蔓延和及早采取有效防治措施具有重要的理论意义和应用价值。
2、香蕉枯萎病菌4号生理小种现有的常用的鉴定和检测方法主要有传统的形态学特征和pcr快速分子检测，传统的形态学特征检测方法需从发病组织中分离病原菌、采用形态学特征对病原菌进行初步鉴定、再通过柯赫氏法则(将病原菌重新回接到寄主植株上，待发病后再重新分离、鉴定，并与原始菌株进行比较)对病原菌进行最终确定种类，并且还要通过病原菌对香蕉不同品种的致病力测定，才能区别出不同的生理小种。这种运用形态学方法进行鉴定不仅困难且耗时费力，不能满足病害快速、准确鉴定、诊断的需求。随着分子生物学技术的发展，常规pcr、巢式pcr和实时荧光定量pcr等dna体外pcr扩增技术成功地应
3、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)技术是日本荣研公司开发的一种简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增技术。该技术针对靶标基因6个特异区设计4条引物，只要其中任何一条引物也靶标错位均不能扩增，所以该技术具有很强的特异性，此外，lamp可利用高活性的链置换dna聚合酶(bst dna polymerase)在60℃～65℃恒温条件下对目的dna片段进行高效扩增，仅需要简单的水浴锅设备便可满足反应要求，整个反应在1小时内完成，并且可用肉眼观察判断结果。横向流动试纸条(lateral flowdipstick,lfd)是一种新的检测方法，该方法无需凝胶成像系统和电泳仪等设备，只需将试纸条浸入杂交液中即可，避免了eb等有毒试剂的污染。lamp与lfd相结合的检测技术(lamp-lfd)具安全、快捷、高效、高灵敏度等优势，且无设备及技术限制。目前，国内外已成功地将lamp-lfd广泛应用于多种病原菌检测中。本专利技术的目的是建立香蕉枯萎病菌4号生理小种lamp-lfd检测体系，为香蕉枯萎病的早期有效和正确鉴定、检测供科学的理论依据。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了用于香蕉枯萎病菌4号生理小种lamp-lfd检测的引物探针组合、试剂盒和方法，本专利技术针对现有技术中对香蕉枯萎病菌4号生理小种检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有pcr分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了香蕉枯萎病菌4号生理小种的lamp-lfd检测方法，实现对香蕉枯萎病菌4号生理小种更快速、准确和灵敏的检测，检测结果可肉眼可视化观察。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了用于香蕉枯萎病菌4号生理小种lamp-lfd检测的引物探针组合，包括fip引物、bip引物、f3引物、b3引物和hp探针；
4、所述fip引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；
5、所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；
6、所述f3引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；
7、所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；
8、所述hp探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。
9、优选的，所述fip引物的5'端使用生物素标记，所述hp探针的5'端使用6-羧基荧光素标记。
10、本专利技术还提供了上述技术方案所述的引物探针组合在鉴定和/或检测香蕉枯萎病菌4号生理小种中的应用。
11、本专利技术还提供了一种用于香蕉枯萎病菌4号生理小种lamp-lfd检测的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合。
12、优的选，还包括lamp反应混合液和bst dna聚合酶。
13、优选的，所述lamp反应混合液的组分包括40mm tris-hcl、20mm(nh4)2so4、20mmkcl、16mm mgso4、1.6mol/l甜菜碱、2.0mm dntps和0.2wt.％trion x-100。
14、本专利技术还提供了一种基于lamp-lfd检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的方法，包括以下步骤：
15、1)提取样品的基因组dna，以所述基因组dna为模板，使用上述技术方案中的fip引物、bip引物、f3引物、b3引物进行lamp扩增，得到扩增产物；
16、2)将所述步骤1)得到的扩增产物与上述技术方案中的hp探针混合、杂交反应，得到杂交液；
17、3)将所述步骤2)得到的杂交液与buffer缓冲液混合，得到混合液；
18、4)将lfd试纸条浸入到步骤3)得到的混合液中，当质控带和检测带均显紫红色时，表示样品中含有香蕉枯萎病菌4号生理小种。
19、优选的，所述步骤1)lamp扩增的体系每25μl含有：5μm的f3引物和b3引物各1μl，40μm的fip引物和bip引物各1.6μl，lamp反应混合液12.5μl，8u bst dna聚合酶1μl和1μl基因组dna，ddh2o补充至25μl；
20、所述lamp扩增的条件为：温度为63℃，时间为60min。
21、优选的，每25μl体系使用20pmol hp探针；
22、所述杂交反应的条件为：温度为63.5℃，时间为5min。
23、优选的，所述步骤3)杂交液与buffer缓冲液的体积比为1:9。
24、本专利技术建立了香蕉枯萎病菌4号生理小种的快速、简便、特异性强、灵敏度高的lamp-lfd检测技术体系，可用于香蕉枯萎病菌4号生理小种的检测，或用于尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种侵染引起的香蕉枯萎病的发病前期、初期本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于香蕉枯萎病菌4号生理小种LAMP-LFD检测的引物探针组合，其特征在于，包括FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物和HP探针；
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述FIP引物的5'端使用生物素标记，所述HP探针的5'端使用6-羧基荧光素标记。
3.权利要求1或2所述的引物探针组合在鉴定和/或检测香蕉枯萎病菌4号生理小种中的应用。
4.一种用于香蕉枯萎病菌4号生理小种LAMP-LFD检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括LAMP反应混合液和Bst DNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应混合液的组分包括40mMTris-HCl、20mM(NH4)2SO4、20mM KCl、16mM MgSO4、1.6mol/L甜菜碱、2.0mM dNTPs和0.2wt.％TrionX-100。
7.一种基于LAMP-LFD检测香蕉枯萎病菌4号生理小种的方法，其特征在于，包括以下步骤：<...
【技术特征摘要】
1.用于香蕉枯萎病菌4号生理小种lamp-lfd检测的引物探针组合，其特征在于，包括fip引物、bip引物、f3引物、b3引物和hp探针；
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述fip引物的5'端使用生物素标记，所述hp探针的5'端使用6-羧基荧光素标记。
3.权利要求1或2所述的引物探针组合在鉴定和/或检测香蕉枯萎病菌4号生理小种中的应用。
4.一种用于香蕉枯萎病菌4号生理小种lamp-lfd检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括lamp反应混合液和bst dna聚合酶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述lamp反应混合液的组分包括40mmtris-hcl、20mm(nh4...
【专利技术属性】
技术研发人员：甘林，兰成忠，杨秀娟，代玉立，刘晓菲，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
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