一种芒果炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种芒果炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法，该方法包括以下４个步骤：（１）芒果炭疽病病原菌基因组ＤＮＡ的提取；（２）ＰＣＲ扩增特异引物及反应条件；（３）酶切ＰＣＲ扩增产物；（４）酶切产物分析；该检测方法对炭疽病病原菌抗性菌株的检出率为１００％；本发明专利技术根据病原菌抗性菌株的特异酶切位点选择一对特异引物进行ＤＮＡ片段（含特异酶切位点）扩增，利用限制性内切酶对扩增ＤＮＡ片段进行酶切，将酶切产物进行电泳、凝胶成像可以准确判断病原菌是抗性菌株还是敏感菌株，经过多次试验表明，这种方法是稳定可靠的。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种芒果炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法，其特征在于：　（１）芒果炭疽病病原菌基因组ＤＮＡ的提取：　　（ａ）取病原菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养５～７天，取培养液过滤获得菌丝体，菌丝体冷冻干燥备用；　　（ｂ）取１５～２５ｍｇ冷冻干燥菌丝体用液氮研磨，转入１．５ｍＬ离心管中，加入３５０～４５０μＬ６０～７０℃水浴的ＳＤＳ提取缓冲液，充分混匀并于６０～７０℃水浴２０～４０ｍｉｎ，间隔摇匀三次；　　（ｃ）１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取２５０～３５０μＬ上清液，加入２５０～３５０μＬ的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，酚∶氯仿∶异戊醇为２０～２８∶２２～２６∶１～３，轻摇３０～４０个来回；　　（ｄ）１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，移上清液到新离心管，加１８０～２５０μＬ氯仿和异戊醇的混合溶液，氯仿和异戊醇的配比为２０～２５∶１～３，轻摇３０～４０个来回；　　（ｅ）１３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，移上清液到新离心管，加１～３倍体积的无水乙醇和浓度为２ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ，使ＤＮＡ充分沉淀；　　（ｆ）１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，待沉淀充分干燥后，用７０％乙醇洗涤沉淀两次；　　（ｇ）沉淀充分干燥后加入４０～６０μＬＴＥ缓冲液，６０～７０℃温浴１～１．５ｈ，使沉淀完全溶解，－２０℃保存病原菌基因组ＤＮＡ备用；　　（２）ＰＣＲ扩增特异引物及反应条件：　　利用正向引物序列ＰＦ１（５’－ＧＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣ－３’）和反向引物序列ＰＲ１（５’－ＧＡＧＣＧＡＡＧＣＣＧＡＣＣＡＴＧＡＡＧ－３’）对病原菌基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，扩增条件：ＰＣＲ反应体系５０μＬ：２５μＬ－Ｐｒｅｍｉｘ－Ｔａｑ，１μＬ（１００ｎｇ）ＤＮＡ模板，正向引物４μＬ，浓度为１００μｍｏｌ／Ｌ，反向引物４μＬ，浓度为１００μｍｏｌ／Ｌ，１６μＬ－ｄｄＨ↓［２］Ｏ；反应循环：９４℃５ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ，５５～６３℃３０ｓ，７２℃２ｍｉｎ，３０个循环；然后７２℃５ｍｉｎ，最后４℃保存ＰＣＲ扩增产物；　　（３）酶切ＰＣＲ扩增产物：取ＰＣＲ扩增产物进行酶切反应，反应体系２０μＬ：ＡＣＣ－Ⅱ限制性内切酶１μＬ，浓度为１２ｕ／μＬ，２μＬ－１０×ＭＢｕｆｆｅｒ，ＤＮＡ扩增产物１μｇ，扩增产物的ＤＮＡ浓度采用核酸分析仪测定或与λＤＮＡ进行琼脂糖电泳比对测定，最后加超纯水至２０μＬ，按反应体系加样至ＰＣＲ管中置于３７℃...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：詹儒林，黄俊生，姚全胜，何衍彪，雷新涛，赵艳龙，常金梅，王松标，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]