一种嗜硫小红卵菌菌剂、胞外蛋白及菌剂和胞外蛋白的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种嗜硫小红卵菌菌株、菌剂、胞外蛋白及菌剂和胞外蛋白的制备方法及应用，所述嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌IV‑1(Rhodovulum sulfidophilum IV‑1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012369，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月26日。本发明专利技术从嗜硫小红卵菌IV‑1菌剂可以分泌出对辣椒炭疽病菌具有拮抗作用的胞外蛋白，从而对辣椒炭疽病起抑制作用；本发明专利技术首次从从嗜硫小红卵菌IV‑1菌剂的胞外产物中提取胞外蛋白，其提取工艺简单、流程短、成本低，提取过程对环境无污染；本发明专利技术从嗜硫小红卵菌IV‑1菌剂中提取获得的蛋白组分分子量约为50kD，热稳定性高、耐储藏、对辣椒炭疽病的抑制作用效果好。

Preparation method and application of sulfur red small egg bacteria strain, bacterial agent, extracellular protein and bacterial agent and extracellular protein

The invention discloses a red egg thiophilic strains and bacteria, extracellular proteins and extracellular proteins of microorganism and preparation method and application of the thiophilic strains for red egg red eggs thiophilic bacteria IV (Rhodovulum sulfidophilum IV 1 1), preserved in Chinese typical culture preserved, the preservation number is CCTCC M 2012369, located in the Chinese preservation unit of Wuhan University, the collection date is September 26, 2012. The invention can produce antagonistic to Colletotrichum capsici extracellular proteins from thermophilic sulfur bacteria IV red eggs 1 agents, thus inhibiting effect on Pepper Anthracnose; the first extraction of extracellular proteins from the extracellular products of thiophilic bacteria IV 1 red egg inoculum, the extraction process is simple, short process, low cost, the extraction process has no pollution to the environment; the invention from the red egg thiophilic bacteria IV 1 bacteria protein extracted by the group of molecular weight is about 50kD, high thermal stability, resistant storage, inhibition effect of Pepper Anthracnose is good.

【技术实现步骤摘要】
一种嗜硫小红卵菌菌株、菌剂、胞外蛋白及菌剂和胞外蛋白的制备方法及应用
本专利技术涉及生物农药
，具体是一种嗜硫小红卵菌菌株、菌剂、胞外蛋白及菌剂和胞外蛋白的制备方法及应用。
技术介绍
辣椒炭疽病(PepperAnthracnose)是辣椒、甜椒上的一种重要病害。在我国，辣椒炭疽病主要由红色炭疽病菌(C.gloeosporioides＝Gloeosporiumpiperatum)、黑色炭疽病菌(C.coccodes＝C.nigrum)、黑点炭疽病菌(C.capsici)和尖孢炭疽菌(C.acutatum(Simmonds))4种病原菌引起。如果气候高温高湿，辣椒炭疽病流行扩展快、危害时间长，可引起辣椒幼苗死亡、烂果，导致辣椒减产30％-50％，严重时甚至高达80％，对辣椒品质、产量及成熟果的加工生产均具有很大影响，是辣椒生产的主要障碍之一。控制和减少炭疽病对辣椒生产的危害，生产上一般采用化学防治等措施来控制。但是随着化学杀菌剂的长期大量使用，不但导致病原物产生耐药性和抗药性，而且杀死有益微生物；同时化学农药随大气循环和水循环扩散到环境中，从而造成环境的污染；再者辣椒作为食用经济作物，对其外观和内在质量均有特殊的要求，农药残留及对食品卫生的影响，限制了化学杀菌剂的大规模利用。随着当今世界对农作物数量和质量需求的不断提高、各国对保护人类生存环境的日益重视、持续农业和持续植物保护观念的不断深入、对环境问题与无公害食品的生产需求日益增加，利用生物防治辣椒炭疽病已势在必行。随着生防菌研究的深入以及生防产品的日益更新，人们开始致力于抗菌活性物质的挖掘。一般将生防菌产生抗菌活性物质的途径分为核糖体合成和非核糖体合成两种。核糖体合成途径产生的抗菌物质有细菌素、酶类和其它活性蛋白类；非核糖体合成途径产生的抗菌物质有脂肽类、抗菌肽及其它类别物质诸如大环内酯类、多烯类、酚类物质等产生的抗菌物质，包括非核糖体合成的脂肽类抗生素、核糖体合成的细菌素等。而在众多活性物质中，抗菌蛋白质作为生物体抵抗病原菌的入侵，维护生命活动的延续和运行的重要天然物质，是重要的抗病资源，在防治辣椒炭疽病方面也将会获得广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种嗜硫小红卵菌菌株、菌剂、胞外蛋白及菌剂和胞外蛋白的制备方法及应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种嗜硫小红卵菌菌株，所述嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌IV-1(RhodovulumsulfidophilumIV-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2012369，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月26日。一种嗜硫小红卵菌菌剂，所述嗜硫小红卵菌菌剂采用上述的嗜硫小红卵菌菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。一种上述的嗜硫小红卵菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：第一步：活化：将嗜硫小红卵菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；第二步：种子培养：将第一步中培养的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH为7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液；第三步：生产培养：将第二步中种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5％，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下，培养至对数生长期；第四步：离心：将第三步中生产培养得到的菌液进行8000rpm、4℃、15min离心后，收集上清，然后用0.22μm滤膜进行抽滤得到滤液，即制得嗜硫小红卵菌菌剂。一种胞外蛋白，所述胞外蛋白从上述的嗜硫小红卵菌菌剂或上述制备方法制备得到的嗜硫小红卵菌菌剂中提取得到。一种上述的胞外蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：第一步：硫酸铵沉淀-盐析：向嗜硫小红卵菌菌剂中加入硫酸铵至85％饱和度，使所述嗜硫小红卵菌菌剂中的蛋白析出，得到混合液；第二步：离心：将所述第一步中得到的混合液以11000rpm转速离心30min得到沉淀，将所述沉淀重悬于PBS缓冲液中得到蛋白重悬液；第三步：ATKA蛋白纯化系统HiTrapDesalting5mL脱盐柱脱盐：将所述第二步中制备得到的蛋白重悬液低温冷冻浓缩后，采用HiTrapDesalting5mL脱盐柱进行脱盐得到蛋白粗品；第四步：ATKA蛋白纯化系统Superdex200Increase10/300GL层析柱层析分离：将第三步中制得的蛋白粗品采用Superdex200Increase10/300GL层析柱进行层析分离得到胞外蛋白。作为本专利技术再进一步的方案：所述第二步中PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.0。作为本专利技术再进一步的方案：所述第三步中蛋白重悬液以15％的上样比例进行HiTrapDesalting5mL柱脱盐得到蛋白粗品，将所述蛋白粗品稀释至10mg/mL。作为本专利技术再进一步的方案：所述第四步中蛋白粗品按2％的上样比例进行Superdex200Increase10/300GL层析柱层析分离。作为本专利技术再进一步的方案：所述第四步中层析分离后获得的各个蛋白组分，然后进行活性测定，合并活性组分，低温冷冻浓缩即得到胞外蛋白。一种根据上述的胞外蛋白或权利要求5-9任一的提取方法提取得到的胞外蛋白的应用，所述胞外蛋白应用于辣椒炭疽病防治。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术从嗜硫小红卵菌IV-1菌剂可以分泌出对辣椒炭疽病菌具有拮抗作用的胞外蛋白，从而起到对辣椒炭疽病的抑制作用。2、本专利技术首次从从嗜硫小红卵菌IV-1菌剂的胞外产物中提取胞外蛋白，其提取工艺简单、流程短、成本低，提取过程对环境无污染。3、本专利技术从嗜硫小红卵菌IV-1菌剂中提取获得的蛋白组分分子量在约50kD，热稳定性高、耐储藏、对辣椒炭疽病的抑制作用明显。附图说明图1为本专利技术实例1中嗜硫小红卵菌IV-1菌株的菌落图片。图2为本专利技术实施例4中辣椒炭疽菌丝平板测定试验图。图3为本专利技术实例4中辣椒炭疽病产孢量测定试验图。图4为本专利技术实例4中辣椒炭疽病原体果实生测试验图。图5为本专利技术实例4中辣椒炭疽病温室生测试验图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。请参阅图1-4，一种嗜硫小红卵菌菌株，所述嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌IV-1(RhodovulumsulfidophilumIV-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2012369，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月26日。一种嗜硫小红卵菌菌剂，所述嗜硫小红卵菌菌剂采用上述的嗜硫小红卵菌菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。一种上述的嗜硫小红卵菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：第一步：活化：将嗜硫小红卵菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；第二步：种子培养：将第一步中培养的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH为7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液；第三步：生产培养：将第二步中种子培养后得到的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嗜硫小红卵菌菌株，其特征在于，所述嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌IV‑1(Rhodovulum sulfidophilum IV‑1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012369，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月26日。

【技术特征摘要】
1.一种嗜硫小红卵菌菌株，其特征在于，所述嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌IV-1(RhodovulumsulfidophilumIV-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2012369，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月26日。2.一种嗜硫小红卵菌菌剂，其特征在于，所述嗜硫小红卵菌菌剂采用权利要求1所述的嗜硫小红卵菌菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。3.一种权利要求2所述的嗜硫小红卵菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：活化：将嗜硫小红卵菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；第二步：种子培养：将第一步中培养的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH为7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液；第三步：生产培养：将第二步中种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5％，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下，培养至对数生长期；第四步：离心：将第三步中生产培养得到的菌液进行8000rpm、4℃、15min离心后，收集上清，然后用0.22μm滤膜进行抽滤得到滤液，即制得嗜硫小红卵菌菌剂。4.一种胞外蛋白，其特征在于，所述胞外蛋白从权利要求2所述的嗜硫小红卵菌菌剂或权利要求3所述制备方法制备得到的嗜硫小红卵菌菌剂中提取得到。5.一种权利要求4所述的胞外蛋白的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：第一步：硫酸铵沉淀-盐析：向嗜硫小红...

【专利技术属性】
技术研发人员：程菊娥，刘勇，张德咏，苏品，谭新球，郑立敏，王忠勇，张松柏，高阳，丁昭仪，翟忠英，陈丽洁，孔小婷，
申请(专利权)人：湖南省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43