一种绵羊肉质相关的基因的检测引物和方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种绵羊肉质的基因检测引物和方法及其应用，所述的引物包括上游引物：5’‑TGGAGTCCATGCAGCAAAC‑3’和下游引物：5’‑AGCCTGTACGGAGCTAACG‑3’，通过将样品基因组DNA扩增测序达到检测目的，本发明专利技术还提供了所述的绵羊肉质的基因检测引物在制备检测绵羊肉质的制剂或试剂盒中应用。本发明专利技术引物用于检测绵羊肉质与传统的分型方法相比，HRM技术方法简单，耗时短，成功率高，更直观，可以大批量进行分型。

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊肉质相关的基因的检测引物和方法及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种绵羊肉质相关的基因检测引物和方法及其应用。
技术介绍
绵羊是我国普遍饲养的家畜之一，饲养历史已有7000余年。羊肉中含有丰富的人体必需的蛋白质、维生素B1、B2、脂肪以及钙、磷、铁、钾、碘等矿物质元素。羊肉鲜嫩，属于温性食物，多食也不会上火，能够健脾，补血，因为吃羊肉可以促进血液循环，所以在我国一些较冷的地方很喜欢在冬天吃羊肉火锅。如今，羊肉再也不是草原的专属美食，也越来越受到人们的喜爱，羊肉的需求量增加的同时，人们对肉质的要求也随之升高。近年来，育种工作者们逐渐将研究方向转移至绵羊肉质方面性状的改善，利用分子育种方法，通过探知影响绵羊肉质性状的候选基因的作用机理，为绵羊提高肉质质量的育种提供理论依据。肌内脂肪的沉积直接会影响羊肉的品质，口感也会有所不同。羊肉中不饱和脂肪酸不仅会影响羊肉的口感而且还是人体所必需的营养物质。长链脂酰辅酶A合成酶家族(long-chainfattyacyl-CoAsynthetases，ACSLs)是哺乳动物利用外源和内源脂肪酸活化催化生成酯酰辅酶A过程中所必需的酶。实验证实长链脂酰CoA合成酶在甘油三酯、磷脂和胆固醇脂的合成以及脂肪酸的代谢中起着关键作用。本实验选用东北细毛羊为实验对象。通过HRM技术分析基因遗传多态性并与肉质性状数据相结合进行相关分析。旨在从分子水平探究ACSL1基因对绵羊体内肌内脂肪沉积的调控作用，为优质绵羊的育种工作提供理论基础和科学依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种绵羊肉质相关的基因检测引物和方法及其应用，为绵羊肉质营养成分相关基因的检测提供一种快速有效的方法，为以提高绵羊肉质质量为目的的育种提供依据。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种绵羊肉质相关的基因检测引物，所述的引物包括上游引物和下游引物：所述的上游引物为：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’所述的下游引物为：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’本专利技术所述的绵羊肉质相关的基因检测引物的PCR反应体系为：取2×MasterMix10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl22μL(2.5mM)，DNA1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH2O补齐至20μL。本专利技术所述的绵羊肉质相关的基因检测引物的PCR反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环。95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。本专利技术还提供了一种绵羊肉质营养成分相关基因的检测方法，具体包括以下步骤：1)提取绵羊样品的基因组DNA，并将基因组保存于-15℃～-20℃；2)以步骤(1)所述的基因组DNA作为模板，通过PCR反应扩增绵羊基因，所述的PCR包括上游引物：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’和下游引物：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’；3)反应结束后根据标准化曲线区分出三种不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增；4)将PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳检测30min；5)确定目的条带后将剩余样品进行胶回收，连接载体克隆得到菌液送到测序公司测序。进一步的，步骤(2)中反应体系为：取2×MasterMix10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl22μL(2.5mM)，DNA1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH2O补齐至20μL。反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环。95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。进一步的，步骤(3)中反应体系为：10×PCRBufferwithMgCl26.25μL，dNTPMixture(10mm)2.25μL，下游引物各1μL，TaqDNApolymerase(2U/μL)1.5μL，DNA1μL，最后用ddH2O补齐至50μL。反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性40s；退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。本专利技术还提供所述的绵羊肉质相关的基因检测引物在制备检测绵羊肉质相关基因的制剂或试剂盒中应用，所述的制剂或试剂盒包括上游引物：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’和下游引物：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’。本专利技术的有益效果为：针对ACSL1基因第2外显子DNA片段突变进行快速分型。与传统的分型方法相比，HRM技术方法简单，耗时短，成功率高，更直观，可以大批量进行分型。附图说明图1是引物对绵羊基因组DNA扩增产物的电泳图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。实施例1本专利技术利用已克隆得到的ACSL1基因序列，设计特异性引物，克隆包括全部第2外显子的部分DNA序列，以东北细毛羊肝组织DNA为试验样品，利用HRM技术对ACSL1基因多态性检测，根据测序得到的不同基因型与肉质性状数据结合进行分析，为优质绵羊育种工作提供理论依据。引物设计：以绵羊ACSL1基因DNA序列为参照，根据HRM试验引物要求设计引物1对，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，目的片段长度为500bp。引物序列：ACSL1基因exon2HRM分型上游引物序列：5’-TTTTCCCAGGGCAGTGA-3’ACSL1基因exon2HRM分型下游引物序列：5’-TTCAGGCCGATGCTTACT-3’ACSL1基因exon2PCR扩增上游引物序列：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’ACSL1基因exon2PCR扩增下游引物序列：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’通过梯度PCR试验确定最佳试验温度，在200μL的PCR离心管中加入PCR反应扩增体系：2×PCRmix10μL，上下游引物各0.2μL，DNA0.5μL，用ddH2O补齐至20μL。将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；设置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。取5μLPCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖凝胶在1×TBE中电泳检测30min。根据条带亮度及清晰度确定最终退火温度。在96孔PCR管中加入HRM反应扩增体系：取2×MasterMix10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl22μL(2.5mM)，DNA1μL(试验前将DNA稀释至50ng/μL)，用ddH2O补齐至20μL.冰上操作，充分混匀后封膜离心30s，放入荧光定量PCR仪。P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绵羊肉质的基因检测引物，其特征在于，所述的引物包括上游引物：5’‑TGGAGTCCATGCAGCAAAC‑3’和下游引物：5’‑AGCCTGTACGGAGCTAACG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种绵羊肉质的基因检测引物，其特征在于，所述的引物包括上游引物：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’和下游引物：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’。2.根据权利要求1所述的一种绵羊肉质的基因检测引物，其特征在于，所述的绵羊肉质的基因检测引物的PCR反应体系为：取2×MasterMix10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl22μL2.5mM，DNA1μL，用ddH2O补齐至20μL。3.根据权利要求1所述的一种绵羊肉质的基因检测引物，其特征在于，所述的绵羊肉质的基因检测引物的PCR反应条件为：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环；95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。4.一种绵羊肉质营养成分基因的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1)提取绵羊样品的基因组DNA，并将基因组保存于-15℃～-20℃。2)以步骤(1)所述的基因组DNA作为模板，通过PCR反应扩增绵羊基因，所述的PCR包括上游引物：5’-TGGAGTCCATGCAGCAAAC-3’和下游引物：5’-AGCCTGTACGGAGCTAACG-3’；3)反应结束后根据标准化曲线区分出三种不同的基因型，然后从每个基因型中选取2-3个样品进行普通的PCR扩增；4)将PCR产物与6×上样缓冲液混合后，用1％琼脂糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹阳，金海国，于永生，张立春，马惠海，魏天，闫秋良，武斌，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：吉林,22