利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法技术

本发明专利技术提供一种利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法，从公共数据库或通过测序技术获取在昆虫触角中表达的嗅觉基因信息，利用特异性挥发物处理昆虫24‑48h，然后检测昆虫触角中不同嗅觉基因的表达量，与对照未经过特异性挥发物处理的昆虫相比，将表达量增加的嗅觉基因，其所编码的蛋白作为候选的昆虫相关嗅觉蛋白。本发明专利技术利用特异性挥发物处理昆虫，建立一种有效、快速筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法。该方法高效、简单，可操作性强，能够在大量的嗅觉基因中快速准确且系统、完整筛选获得靶标基因，为研究昆虫对特异性挥发物的嗅觉识别机理提供技术支持。

Method for screening insect associated olfactory proteins using specific volatiles

The present invention provides a method for using specific volatiles screening insect olfactory related proteins, gene expression in insect olfactory information acquisition tentacles from public databases or by sequencing, using specific volatiles processing 24 insects 48h, then detect the expression of different olfactory genes in insect antennae, and without specific control of the volatiles processing insect olfactory genes compared to expression increased, its encoding protein as insect olfactory related protein candidate. The invention utilizes specific volatiles to treat insects, and establishes a method for effectively and rapidly screening insect related olfactory proteins. This method is efficient, simple, strong operability, can in a large number of genes in olfactory system, fast and accurate and complete screened target genes, provide technical support for the research of insect olfactory mechanism of specific volatiles.

【技术实现步骤摘要】
利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法。
技术介绍
昆虫对气味分子的识别和鉴定主要依赖于高度敏感的嗅觉系统，其包括一系列的过程，首先脂溶性小分子化合物的气味物质借助气味结合蛋白等小分子量触角蛋白的携带，穿过气－液相界面到达嗅觉受体，在触角嗅觉受体内完成对气味的识别，然后刺激神经元，将化学信号转变为电信号，逐级上传形成神经冲动，使昆虫产生特异的生理和行为反应。其在对气味识别过程中涉及到的嗅觉相关蛋白主要包括气味结合蛋白(odorantbindingproteins,OBPs)、气味受体(odorantreceptors,IRs)、气味降解酶(odorantdegradingenzymes,ODEs)、离子型受体(ionotropicreceptors,IRs)以及感觉神经元膜蛋白(sensoryneuronmembraneproteins,SNMPs)。自从首个气味结合蛋白于1981年在多音天蚕蛾中被发现以来，通过生物化学、遗传学、分子生物学、生物物理学、结构生物学以及RNA干扰和电生理学等一系列的研究方法和手段，共计8个目50余种昆虫嗅觉蛋白的功能在逐步被揭示，昆虫嗅觉蛋白的研究越来越受到有关科学工作者的关注。随着多个昆虫基因组测序工作的陆续完成，已经明确昆虫嗅觉蛋白多达上百种，但是如何能够快速、准确的明确这些蛋白的功能是目前急需解决的一个课题。目前对昆虫嗅觉蛋白的功能研究基本是在单个蛋白的基础上进行的，较为常用的方法是根据基因的同源性进行引物设计，克隆相关基因，随后开展蛋白功能研究。但是，由于嗅觉蛋白种类较多，未经筛选的开展所有嗅觉蛋白的功能研究是非常庞大的任务。同时，由于昆虫嗅觉蛋白与其所识别的化合物之间并非一一对应的关系，昆虫识别某一种化合物可能是多个蛋白在共同作用，仅仅某一个蛋白的功能研究并不能完整、准确的解析昆虫对某一种特异性挥发物的识别机理。因此，如果在开展嗅觉蛋白功能研究之前，能够首先快速、准确和系统、完整的筛选出与识别特异性挥发物相关的嗅觉蛋白，不仅让我们有针对性地开展嗅觉蛋白的功能研究，节约了时间，对于我们系统而完整的开展昆虫对信息化合物的嗅觉识别机理也具有重要意义。华北大黑鳃金龟属鞘翅目金龟科，是世界性的农业害虫，为我国东北、华北、西北地区以及东南沿海省等地区地下害虫的优势类群。金龟甲的幼虫通称“蛴螬”，其在土壤中发生为害，咬食植物的幼苗、根、茎、种子及块根、块茎等，对玉米、薯类、豆类、棉花、花生、甜菜及小麦等农作物和蔬菜、果树、林木幼苗等造成危害，降低产量，影响品质，严重地块可造成绝收，据调查统计，植物地下受害部分的86％是由蛴螬危害造成的。华北大黑鳃金龟成虫具有聚集取食习性，尤其对蓖麻具有偏嗜性。研究表明，蓖麻对华北大黑鳃金龟成虫诱集效果明显。因此，利用寄主植物或其挥发物诱集成虫为华北大黑鳃金龟成虫防治提供了可能，而华北大黑鳃金龟对寄主植物的准确识别和定位主要依赖于高度敏感的嗅觉系统，其中筛选识别特异化合物识别的相关嗅觉是其最重要的方面。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法，从公共数据库或通过测序技术获取在昆虫触角中表达的嗅觉基因信息，利用特异性挥发物处理昆虫24-48h，然后检测昆虫触角中不同嗅觉基因的表达量，与对照未经过特异性挥发物处理的昆虫相比，将表达量增加的嗅觉基因，其所编码的蛋白作为候选的昆虫相关嗅觉蛋白。所述特异性挥发物主要是指可引起昆虫特异行为反应的挥发性化合物，包括寄主植物挥发物、昆虫性信息素和聚集信息素等。前述方法包括以下步骤：1)提取昆虫触角RNA，转录组测序获得大量在昆虫触角中表达的嗅觉基因；2)将昆虫成虫置于设有透气孔的养虫箱中，饥饿处理24-48h(优选24h)；然后将可持续释放特异性挥发物的容器放入养虫箱中，24-48h(优选24h)后取昆虫触角，提取RNA；同时设立对照组，即饥饿处理后的昆虫进行正常饲喂，24-48h(优选24h)后取昆虫触角，提取RNA；3)检测昆虫触角中不同嗅觉基因表达量的变化。前述方法中，步骤2)所述昆虫成虫为羽化后2日龄成虫。其中，可持续释放特异性挥发物处理组昆虫与对照组昆虫同日龄。前述方法中，步骤2)所述养虫箱的材质包括有机玻璃，养虫箱的顶端设有一个直径为1cm小孔作为透气孔，箱体为正方体或长方体。养虫箱的容积不能小于0.3m3，否则影响成虫的正常活动，也不能大于1m3，否则挥发物的处理难以达到预期效果。每次提取RNA均需50头成虫的触角。前述方法中，步骤2)将5个可持续释放特异性挥发物的容器分别置于养虫箱的四个角落和中间。其中，所述可持续释放特异性挥发物的容器为盛有特异性挥发物溶液的玻璃瓶，所述玻璃瓶用封口膜封口，封口膜上设有若干透气孔。前述方法中，步骤3)是将触角RNA反转录成cDNA，并利用荧光定量PCR检测昆虫触角中不同嗅觉基因的表达量。前述方法中，所述昆虫相关嗅觉蛋白包括但不限于气味结合蛋白。所述昆虫包括但不限于华北大黑鳃金龟。前述方法中，所述特异性挥发物包括芳樟醇，反-2-己烯醇等。用于荧光定量PCR的引物序列见表1。表1引物序列(5′-3′)荧光定量PCR的反应体系为：每个反应体系对应于表1中一对引物组合。反应程序为：95℃60s；95℃5s，60℃15s，40个循环。本专利技术利用特异性挥发物处理昆虫，建立一种有效、快速筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法。该方法高效、简单，可操作性强，能够在大量的嗅觉基因中快速准确且系统、完整筛选获得靶标基因，为研究昆虫对特异性挥发物的嗅觉识别机理提供技术支持。附图说明图1为本专利技术实施例1中利用荧光定量PCR检测芳樟醇处理华北大黑鳃金龟雄虫触角后不同OBPs基因的表达结果；其中，CK代表空白对照，芳樟醇为华北大黑鳃金龟性信息素成分，OBP1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、21、22、24、25、26、27、28为华北大黑鳃金龟雄虫触角中表达的气味结合蛋白。图2为本专利技术实施例2中利用荧光定量PCR检测反-2-己烯醇处理华北大黑鳃金龟雌虫触角后不同OBPs基因的表达结果；其中，CK代表空白对照，反-2-己烯醇为华北大黑鳃金龟寄主植物挥发物成分，OBP1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、23、27为华北大黑鳃金龟雌虫触角中表达的气味结合蛋白。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1华北大黑鳃金龟触角中识别性信息素芳樟醇气味结合蛋白的筛选1、提取华北大黑鳃金龟触角RNA，转录组测序获得大量在昆虫触角中表达的嗅觉基因，含OBP、CSP、OR、IR和SNMP。结果如下：>HoblOBP1MRSNIKMFKNSALFILGIILPS本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法，其特征在于，从公共数据库或通过测序技术获取在昆虫触角中表达的嗅觉基因信息，利用特异性挥发物处理昆虫24‑48h，然后检测昆虫触角中不同嗅觉基因的表达量，与对照未经过特异性挥发物处理的昆虫相比，将表达量增加的嗅觉基因，其所编码的蛋白作为候选的昆虫相关嗅觉蛋白。

【技术特征摘要】
1.利用特异性挥发物筛选昆虫相关嗅觉蛋白的方法，其特征在于，从公共数据库或通过测序技术获取在昆虫触角中表达的嗅觉基因信息，利用特异性挥发物处理昆虫24-48h，然后检测昆虫触角中不同嗅觉基因的表达量，与对照未经过特异性挥发物处理的昆虫相比，将表达量增加的嗅觉基因，其所编码的蛋白作为候选的昆虫相关嗅觉蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性挥发物是指可引起昆虫特异行为反应的挥发性化合物，包括寄主植物挥发物、昆虫性信息素和聚集信息素。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取昆虫触角RNA，转录组测序获得大量在昆虫触角中表达的嗅觉基因；2)将昆虫成虫置于设有透气孔的养虫箱中，饥饿处理24-48h；然后将可持续释放特异性挥发物的容器放入养虫箱中，24-48h后取昆虫触角，提取RNA；同时设立对照组，即饥饿处理后的昆虫进行正常饲喂，24-48h后取昆虫触角，提取RNA；3)检测昆虫触角中不同嗅觉基因表达量的变化。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述昆虫成虫为羽化后2日龄成虫。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹姣，李克斌，张帅，房迟琴，王超群，曹雅忠，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11