一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理；（2）构建恒温扩增反应体系；（3）荧光定量反应；（4）检测分析。本发明专利技术提供的针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。

Method for detecting Salmonella typhimurium in food

The present invention discloses a kind of Salmonella typhimurium in food detection method, using isothermal amplification method for Salmonella typhimurium spvC gene specific sequence for the target sequence, SYBER Green II fluorescent dye, followed by quantitative fluorescence detection; the specific process includes the following steps: (1) pretreatment; (2) construction of isothermal amplification reaction system; (3) fluorescence quantitative reaction; (4) detection and analysis. Detection method for Salmonella typhimurium provided by the invention has the advantages of simple, rapid, specific, sensitive and economical, the judgment method is simple and suitable for clinical or basic laboratory use, has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法
本专利技术涉及一种细菌检测方法，具体是一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法。
技术介绍
鼠伤寒沙门氏菌是常见的沙门氏菌致病的血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热，对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，形成了哥本哈根变种、宾斯变种及O型变种三个变种。鼠伤寒沙门氏菌的检测主要是依靠传统的培养的方法(可参见国标GB/T4789.4-2008)，正如刘振湘在《特产研究》2007年第1期第56～57页发表的题为“白鹭鼠伤寒沙门氏菌的分离与鉴”文中提及，该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试来鉴定，虽然结果可靠，但是操作复杂，费时费力，通常要3～5天才能得出检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情的蔓延。为了能够快速、准确、简便的检验鼠伤寒沙门氏菌，以分子生物学为基础的检测方法在实践检验中不断取得新进展，成为取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一。PCR技术以其操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，逐步应用于沙门氏菌的检疫之后，对沙门氏菌病的诊断和防治工作起到了积极作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种结构简单、使用方便的食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBERGreenII为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为25-30℃，培养时间为18-24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板1.3μL，SYBERGreenII荧光染料0.2μL，10×Buffer2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP3μL，DNA引物2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述SYBERGreenII荧光染料为80-100倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、碳酸铵；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述磷酸氢二钠溶液的浓度为8-15mmol/L；所述枸橼酸钠溶液的浓度为15-35mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述硫酸铁溶液的浓度为10-15mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，90-96℃变性1-2min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，最后72℃延伸10min；（4）检测分析：根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（1）中培养温度为28℃，培养时间为21h。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA模板的OD260/OD280值为1.8。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述SYBERGreenII荧光染料为90倍稀释。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述磷酸氢二钠溶液的浓度为11mmol/L。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述枸橼酸钠溶液的浓度为25mmol/L。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述DNA引物的OD260/OD280值为1.8。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（2）中所述硫酸铁溶液的浓度为13mmol/L。作为本专利技术进一步的方案：具体步骤（3）中93℃变性1.5min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的针对鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，具有简便、快速、特异、灵敏和经济的优点，结果判断方法简便，适合于临床或者基层实验室使用，具有广阔的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。实施例1一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBERGreenII为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为25℃，培养时间为18h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板1.3μL，SYBERGreenII荧光染料0.2μL，10×Buffer2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP3μL，DNA引物2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；所述SYBERGreenII荧光染料为80倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、碳酸铵；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述磷酸氢二钠溶液的浓度为8mmol/L；所述枸橼酸钠溶液的浓度为15mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7；所述硫酸铁溶液的浓度为10mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随后进行扩增，95℃变性5min，90℃变性1min；65℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环，最后72℃延伸10min；（4）检测分析：根据荧光定量分析软件进行定量分析，结果统计。实施例2一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBERGreenII为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为26℃，培养时间为20h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板1.3μL，SYBERGreenII荧光染料0.2μL，10×Buffer2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP3μL，DNA引物2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7；所述SYBERGreenII荧光染料为85倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、碳酸铵；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述磷酸氢二钠溶液的浓度为9mmol/L；所述枸橼酸钠溶液的浓度为20mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBER Green II为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为25‑30℃，培养时间为18‑24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯‑溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板 1.3μL，SYBER Green II荧光染料 0.2μL，10×Buffer 2.6μL，DNA聚合酶 15U，磷酸氢二钠溶液 1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP 3μL，DNA引物 2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用dd H

【技术特征摘要】
1.一种食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测方法，其特征在于，采用恒温扩增方法，以鼠伤寒沙门氏菌spvC基因特异序列为靶序列，SYBERGreenII为荧光染料，随后进行荧光定量检测分析；具体过程包括如下步骤：（1）预处理：在无菌环境下，将食品加入到NB营养肉汤中，培养温度为25-30℃，培养时间为18-24h，培养结束后，反复使用生理盐水进行清洗，随后提取质粒，使用溶菌酶和EDTA处理细菌，加入SDS裂解并通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心获得质粒；（2）构建恒温扩增反应体系：DNA模板1.3μL，SYBERGreenII荧光染料0.2μL，10×Buffer2.6μL，DNA聚合酶15U，磷酸氢二钠溶液1.5μL，枸橼酸钠溶液0.1μL，dNTP3μL，DNA引物2.4μL，硫酸铁溶液1μL，其余用ddH2O补足至30μL；所述DNA模板的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述SYBERGreenII荧光染料为80-100倍稀释；所述Buffer中含有KCl、Tris-HCl（pH8.3）、碳酸铵；所述DNA聚合酶采用Pfu聚合酶；所述磷酸氢二钠溶液的浓度为8-15mmol/L；所述枸橼酸钠溶液的浓度为15-35mmol/L；所述DNA引物的OD260/OD280值为1.7-1.9；所述硫酸铁溶液的浓度为10-15mmol/L；（3）荧光定量反应：将恒温扩增反应体系加入到荧光定量机中，随...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敏芳，徐静，赵春城，胡勇，蒋韦艳，刘金杰，
申请(专利权)人：无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32