The application of vector strain of recombinant antibody of the invention provides a DNase expression I, AIF or integrated with the toxin and the strain. The technical scheme is based on a specific recognition of TEM1 protein antibody, combined with the characteristics of tumor specific attenuated Salmonella typhimurium VNP20009 accumulation and intracellular invasion, carrying human I and Aif toxin DNase to specific tumor killing effect. Specifically, the construction of the first Abvec Igk DNase I, Abvec Igk T18 DNase I, Abvec Aif, Abvec Igk Igk T18 Aif recombinant plasmid was amplified by electroporation into the Salmonella typhimurium strain VNP20009, the reduction characteristics of toxin typhimurium intracellular Salmonella invasion, expression of the host protein to achieve HEK293 T cells, the serum containing penicillin and streptomycin medium to kill Salmonella typhimurium reduced cells inside and outside, the recombinant plasmid was released into eukaryotic cells, the cells were broken to obtain supernatant containing protein.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学
,进一涉及基因重组与转染方法的研究,同时涉及目的蛋白的表达及其功能验证,具体涉及一种表达DNaseI、AIF或整合有该毒素的重组单链抗体的载体菌株及该菌株的应用。
技术介绍
脱氧核糖核酸酶I(DeoxyribonucleaseI,DNaseI)是一种特异性DNA水解酶,由260个氨基酸组成的单体糖蛋白,包括两个二硫键(Cys101-Cys104,Cys173-Cys209)和两个潜在的N-连接糖基化位点(Asn18和Asn106)。在Ca2+和Mg2+等二价金属离子存在的中性pH值条件下能水解双链DNA生成5'磷酸末端和3'羟基末端的寡核苷酸。DNaseI除了作为一种消化酶,参与食物来源DNA的降解;随研究的深入,发现内源性DNaseⅠ参与细胞凋亡过程中DNA降解生成DNAladder,同时外源性DNaseI可以通过与其细胞表面手提——非阳离子依赖性甘露糖-6磷酸/胰岛素样生长因子(CI-MPR),作为转录因子上调与细胞凋亡密切相关的Fas基因表达;并且,细胞坏死过程中,血浆纤溶系统激活,协同DNaseI进入坏死细胞并在核附近聚集,高效水解坏死细胞染色质DNA。细胞凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor,AIF),是一类存在于线粒体内外膜之间的保守的黄素蛋白,可诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26,其转录产生的mRNA的长度为2.4kb,编码产生的蛋白质有三个不同长度的可变剪接体,它们的氨基酸数分别为613、609和326。除可诱导细胞凋亡外,AIF兼具氧化还原酶的活性 ...
【技术保护点】
表达DNase I、AIF或整合有该毒素的重组单链抗体的载体菌株,其特征在于该菌株是由以下方法制备的:1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18‑DNase I表达基因、序列如SEQ ID No.2所示的DNase I表达基因、序列如SEQ ID No.3所示的T18‑AIF表达基因、序列如SEQ ID No.4所示的AIF表达基因,分别通过酶切方式与Abvec‑Igk质粒连接,分别得到重组质粒Abvec‑Igk‑T18‑DNase I、Abvec‑Igk‑DNase I、Abvec‑Igk‑T18‑Aif、Abvec‑Igk‑Aif;2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec‑Igk‑T18‑DNase I、Abvec‑Igk‑DNase I、Abvec‑Igk‑T18‑Aif、Abvec‑Igk‑Aif,在宿主细胞中进行质粒扩增;3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec‑Igk‑T18‑DNase I、Abvec‑Igk‑DNase I、Abvec‑Igk‑T18‑Aif、Abvec‑Igk‑Aif,分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中,即得到所 ...
【技术特征摘要】
1.表达DNaseI、AIF或整合有该毒素的重组单链抗体的载体菌株,其特征在于该菌株是由以下方法制备的:1)取序列如SEQIDNo.1所示的T18-DNaseI表达基因、序列如SEQIDNo.2所示的DNaseI表达基因、序列如SEQIDNo.3所示的T18-AIF表达基因、序列如SEQIDNo.4所示的AIF表达基因,分别通过酶切方式与Abvec-Igk质粒连接,分别得到重组质粒Abvec-Igk-T18-DNaseI、Abvec-Igk-DNaseI、Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif;2)分别取步骤1)所得重组质粒Abvec-Igk-T18-DNaseI、Abvec-Igk-DNaseI、Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif,在宿主细胞中进行质粒扩增;3)分别收集步骤2)扩增后的重组质粒Abvec-Igk-T18-DNaseI、Abvec-Igk-DNaseI、Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif,分别通过电转法导入处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株中,即得到所述表达DNaseI、AIF或整合有该毒素的重组单链抗体的载体菌株。2.根据权利要求1所述表达DNaseI、AIF或整合有该毒素的重组单链抗体的载体菌株,其特征在于:所述T18-DNaseI表达基因是以pET302-T18-DNAseI为模板,以序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.7所示的DNA片段为引物,经PCR扩增得到的;所述DNaseI表达基因是以pET302-T18-DNAseI为模板,以序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.9所示的DNA片段为引物,经PCR扩增得到的;所述T18-AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板,以序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.7所示的DNA片段为引物,经PCR扩增得到的;所述AIF表达基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif为模板,以序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.8所示的DNA片段为引物,经PCR扩增得到的。3.根据权利要求1所述表达DNaseI、AIF或整合有该毒素的重组单链抗体的载体菌株,其特征在于步骤2)所述宿主细胞是E.coliTop10。4.根据权利要求1所述表达DNaseI、AIF或整合有该毒素的重组单链抗体的载体菌株,其特征在于步骤1)所述酶切方式是经Age...
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