一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法技术

本发明专利技术提供了一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，该方法利用减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性，携带重组质粒进入真核细胞从而实现特定蛋白的表达。具体来看，本发明专利技术先将重组的真核表达质粒通过电击转化导入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株胞内，而后将重组细菌与真核细胞共孵育培养，最后利用含青霉素、链霉素的血清培养基杀死细胞内外的减毒鼠伤寒沙门氏菌，使重组质粒释放至真核细胞中进而实现特定蛋白的表达。与常规的硫酸钙转染、脂质体转染和电转化相比，本发明专利技术以活菌为特定质粒的承载宿主，只需常规培养即可获得大量目的载体；此外，本发明专利技术简化了质粒转染的操作步骤、降低了成本，其转染效率和细胞毒性全面优于常规的转染方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因重组
，具体涉及一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法。
技术介绍
鼠伤寒沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，鼠伤寒沙门氏菌进入宿主消化道后，首先黏附并侵入小肠上皮细胞，小肠黏膜内存在一组集合的淋巴滤泡，被称为派伊尔结(Peyer’sPatches，PPs)。M细胞(Microfoldcell)则是在PPs表面稀疏分布的微皱褶细胞，被肠上皮细胞紧紧包围。细胞较高的通透性使其不仅可以转运可溶性大分子，而且还可以转运颗粒性物质和完整的微生物。它的主要功能是能够穿过肠道上皮屏障将黏膜表面的抗原物质转运至细胞内，并将抗原提呈给淋巴细胞而引发机体的初级免疫应答。通过某些方法减毒的鼠伤寒沙门氏菌仍具有良好的侵袭力，因此它同样可经细胞转运进入机体。现有技术中将外源基因导入载体细胞的基因重组方法主要包括脂质体转染法，病毒转染法，电转法等。其中，通过电刺激转染的方法对细胞存在一定伤害，虽然成本极低，但是也极大的降低了转染效率；病毒转染法是通过以人类免疫缺陷I型病毒为基础开发的一种慢病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，能够有效地将DNA整合到宿主基因组中，效率最高，主要用于原代细胞、干细胞、不分化的细胞等一些难转染的细胞，或用于稳定细胞系的构建，但是技术成本在所有转染方法中最高。脂质体转染法是通过阳离子脂质包裹DNA后与细胞膜融合转运到细胞内，能高效转染，虽然相较于病毒转染成本有所降低，但整体上仍存在成本较高、不易操作等问题。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，以解决现有技术的真核细胞质粒转染方法成本较高的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中可选的真核细胞质粒转染方法较为局限。本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术的真核细胞质粒转染方法效率较低。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，包括以下步骤：1)制备减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株的感受态细胞；2)取待转染质粒，通过电转法导入步骤1)所述感受态细胞中，筛选阳性克隆，得到重组细菌；3)取HEK293-T细胞与步骤2)所得的重组细菌，以二者的细胞量为1:20～1:200的比例在细胞培养板中混合，培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h。在以上技术方案的基础上，还可以进一步考察转染效率，具体实现模式可依据本领域的常规方法进行实际选择，包括但不限于增强绿色荧光蛋白法、光镜直接观察、蛋白标签鉴定、流式细胞技术等常规的转染效率评价方法。作为优选，步骤3)更换培养基之前的培养时间为10h。作为优选，步骤3)中HEK293-T细胞的加入量为8000～12000个/孔。作为优选，步骤3)所述混合后，细胞培养板的每孔中液体总量为450～550μL。作为优选，步骤3)所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。作为优选，步骤2)所述的电转法包括以下步骤：取待转染质粒与步骤1)所述感受态细胞在电转杯中混合，而后以电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms作为优选，所述电转杯的规格是0.1cm。作为优选，步骤2)所述筛选阳性克隆是通过氨苄青霉素抗性筛选的。作为优选，步骤1)具体包括以下操作：A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；B)挑取单菌落接种于3～7mlLB液体培养基中，35～39℃振荡培养10～14h；C)取步骤B)培养所得的菌液，按1:80～1:120的体积比接种于LB液体培养基中，振荡培养至菌液OD值不小于0.4；D)冰浴15～25min后，离心取沉淀用1/8～1/12体积预冷的无菌去离子水洗涤，而后离心取沉淀用1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)浓度的甘油洗涤菌体，再离心沉淀重悬于1/80～1/120体积预冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。在此基础上进一步优选的：所制备的感受态细胞在-80℃条件下留存备用；步骤C)中LB液体培养基的用量为100mL；步骤D)中无菌去离子水洗涤的次数是2次。作为优选，所述离心的条件均为：4℃条件下以3000rpm的转速离心10min。作为优选，所述待转染质粒，是以pTriex为表达载体、整合有TEM1抗体表达基因部分片段的重组质粒；在此基础上进一步优选的，所述整合是利用PCR技术扩增TEM1全长，之后利用内切酶双酶切TEM1片段和pTriex表达载体，利用T4连接酶将TEM1片段插入到pTriex表达载体的多克隆位点在以上技术方案中，真核表达载体不局限于pTriex载体，所有可以以哺乳动物作为宿主细胞的真核表达质粒均可用于本专利技术。作为优选，所述重组质粒上还整合有EGFP基因；步骤3)完成后继续执行以下步骤4)：利用荧光显微镜观察细胞中荧光蛋白表达水平，确定其细胞毒害作用和转染效率。本专利技术提供了一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，该技术方案以鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株作为媒介，先将重组质粒通过电击转化与细菌基因组整合，得到重组细菌，而后再利用该细菌对病毒的侵染性实现转染，最后利用抗生素杀死细胞内外的鼠伤寒沙门氏菌，释放出的真核质粒实现特定蛋白的表达。在以上技术方案中，鼠伤寒沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，VNP20009株作为目前应用较多的品系，减毒后仍可保持良好的侵袭力，因此它入侵机体的途径与野生菌株相似，仍通过黏膜上皮细胞途径和非上皮细胞(树突细胞)途径两种方式侵入机体。本专利技术的技术效果主要体现在以下几方面：1，本专利技术所使用的质粒存在于活的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，只需要对减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009进行简单培养，即可获得大量可用于转染的目的菌。与传统磷酸钙、电转和脂质体繁琐的载体制备程序相比，简单、便捷、成本低。2，传统磷酸钙、电转和脂质体转染法对细胞均有很大的毒害作用，其均以牺牲大量宿主细胞为代价。本专利技术使用的鼠伤寒沙门氏菌为哺乳动物胞内寄生菌，和宿主细胞属于共生关系，对宿主细胞基本没有毒害作用，且细菌和细胞共孵育过程中，细菌可均匀地被哺乳动物摄入细胞内，因此具备转染效率均一、毒害小等优点。3，本专利技术所用的含目的质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009可以以液体和冻干粉形式保存，如需要直接活化即可用于转染实验，方便、快捷。4,本专利技术所用的转染效率可达到80-95％，与磷酸钙法的10-20％、脂质体转染法的30-50％和电转法30-45相比，具有明显优势。本专利技术所用的转染方法对细胞活性几乎无任何影响，而磷酸钙法的活率为4-20％、脂质体转染法的活率为50-80％和电转法活率为1-20％。附图说明图1是本专利技术实施例1中TEM1-GFP蛋白在HEK293T细胞内表达荧光结果图。具体实施方式以下将对本专利技术的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，其特征在于包括以下步骤：1)制备减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株的感受态细胞；2)取待转染质粒，通过电转法导入步骤1)所述感受态细胞中，筛选阳性克隆，得到重组细菌；3)取HEK293‑T细胞与步骤2)所得的重组细菌，以二者的细胞量为1:20～1:200的比例在细胞培养板中混合，培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h。

【技术特征摘要】
1.一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，其特征在于包括以下步骤：1)制备减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株的感受态细胞；2)取待转染质粒，通过电转法导入步骤1)所述感受态细胞中，筛选阳性克隆，得到重组细菌；3)取HEK293-T细胞与步骤2)所得的重组细菌，以二者的细胞量为1:20～1:200的比例在细胞培养板中混合，培养4～16h，而后将细胞培养板中的培养基更换为含有针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素的细胞培养基，培养40～56h。2.根据权利要求1所述的一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，其特征在于步骤3)中HEK293-T细胞的加入量为8000～12000个/孔。3.根据权利要求1所述的一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，其特征在于步骤3)所述混合后，细胞培养板的每孔中液体总量为450～550μL。4.根据权利要求1所述的一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，其特征在于步骤3)所述针对鼠伤寒沙门氏菌的抗生素是青霉素和链霉素。5.根据权利要求1所述的一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，其特征在于步骤2)所述的电转法包括以下步骤：取待转染质粒与步骤1)所述感受态细胞在电转杯中混合，而后以电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms。6.根据权利要求5所述的一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法，其特征在于所述电转杯的规格是0....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈廷涛，辛洪波，王鑫，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36