本发明专利技术公开了一种抗乙型副伤寒O‑SP单克隆抗体及杂交瘤细胞株和应用。所述杂交瘤细胞命名为WV‑SPB‑11，保藏编号：CCTCC NO:C2015228。所述单克隆抗体由权利要求1中的杂交瘤细胞株分泌。本发明专利技术制得的单克隆抗体纯度高，抗体滴度高，符合后续实验要求，本发明专利技术运用单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法测定甲型副伤寒O‑SPO‑SP的多糖含量，特异性强、灵敏度高，尤其不与甲型副伤寒O‑SP多糖、0SP多糖结合物等发生交叉反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于单克隆抗体
，尤其涉及一种抗乙型副伤寒O-SP单克隆抗体及杂交瘤细胞株和应用。
技术介绍
伤寒沙门氏菌，甲型、乙型副伤寒沙门菌是一组导致菌血症的严重的肠道传染性疾病，随着伤寒Vi多糖疫苗的广泛应用，伤寒的发病率逐渐降低，但近年来甲型、乙型副伤寒的发病率却在不断升高，发病人数不断增加已越来越引起人们的重视。发病菌株的迁移，单价的伤寒系列疫苗已无法提供长久的人群保护，而研制多价结合疫苗就成为一个必然选择。曾有伤寒、甲型、乙型副伤寒菌体疫苗用于预防伤寒、副伤寒，但因其为全菌体疫苗，局部及全身不良反应严重，以及对甲乙型副伤寒的预防免疫效果不能确定，已有近20年不再使用。由于抗生素耐药的伤寒、副伤寒菌株的增多，治疗难度也日渐增大。且伤寒、副伤寒多糖属于非胸腺依赖性抗原，不能产生免疫记忆性，尤其对5岁以下儿童和先天免疫缺陷人群存在低免疫原性的问题，因此迫切需要新的思路来研究开发易导致人群感染的伤寒副伤寒疫苗，多价伤寒副伤寒组分或多糖蛋白结合疫苗的联合疫苗是现阶段最有希望的预防性疫苗。甲型副伤寒O-SP和乙型副伤寒O-SP(O-SPecific polysaccharide,O-SP)检 测其多糖含量是衡量抗原含量的指标，一般通过蒽酮法检测多糖含量。然而甲、乙型副伤寒的O-SP在结构上仅有微小的差异，采用蒽酮等常规方法很难区分甲、乙型副伤寒的O-SPO-SP，另外，也由于他们之间的微小差异，在单克隆细胞株的筛选上有较大的难度。脂多糖中的O-特异性链又称O-多糖(O-SP)，是脂多糖最外层的部分，由数十个相同的寡糖单位组成。O-特异性链借糖苷与外核心相连，O-多糖是具有抗原性的，因此，成为了疫苗开发的基础。甲型副伤寒和乙型副伤寒抗原的区别主要是在O-特异性多糖O2因子和O4因子的区别，甲型副伤寒O2因子是泊雷糖，而乙型副伤寒的O4因子为阿比可糖。除此之外，抗原的其余结构完全一致。而O-抗原的不同，决定了不同的血清型。也因为两个型别之间的差距如此微小，使用传统的化学基团检测不能有效区别检测甲型副伤寒和乙型副伤寒，同时，也使得单克隆抗体的筛选变得异常艰难。且甲型副伤寒O-SP分子量较小，暴露的特异性位点不明显也会影响免疫效果。甲型副伤寒和乙型副伤寒抗原结构图分别如图1和图2所示，可以直观的了解两个血清型的微小区别，仅有颜色突出的位点的差异。单克隆抗体(简称单克隆抗体)技术，自1975由德国科学家Kholer和英国科学家Melstein利用杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，成功的建立了单克隆抗体制备技术后，经过30多年的发展，因其特异性强、灵敏度高、可大量生产、容易标准化、用不纯的抗原可以制备出纯的单克隆抗体等优点，单克隆抗体产品已在生物制品、医学疾病的诊断和治疗方面成为一种不可多得的的研究工 具和治疗药物，几乎渗透生物学、医学、工农业甚至食品卫生等各个领域，发挥着不可替代的作用。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种抗乙型副伤寒O-SP单克隆抗体及杂交瘤细胞株和应用。本专利技术还筛选并保藏了一株能产生抗乙型副伤寒O-SP结合疫苗的特异性抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能稳定地、特异地产生针对乙型副伤寒O-SP结合疫苗的单克隆抗体。本专利技术的技术方案如下：一种分泌抗乙型副伤寒O-SP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株WV-SPB-11，保藏编号为CCTCC No：C2015228，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间：2015年12月17日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。本专利技术还提供所述杂交瘤细胞产生的抗乙型副伤寒O-SP的单克隆抗体。所述单克隆抗体以乙型副伤寒O-SP多糖结合疫苗为免疫原，免疫小鼠后制备得到。所述单克隆抗体制备过程采用ELISA间接竞争法筛选。所述乙型副伤寒O-SP结合疫苗的载体蛋白为破伤风类毒素蛋白(TT)。本专利技术还提供所述抗乙型副伤寒O-SP多糖的单克隆抗体在检测乙型副伤寒O-SP多糖含量中的应用。所述乙型副伤寒O-SP多糖来源于含乙型副伤寒O-SP的多糖疫苗、结合疫苗以及多价联合疫苗。检测乙型副伤寒O-SP多糖含量过程采用间接竞争ELISA方法。本专利技术运用单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法测定乙型副伤寒O-SP的多糖含量，特异性强、灵敏度高。本专利技术还提供含有所述抗乙型副伤寒O-SP的单克隆抗体的检测试剂盒。研究表明：乙型副伤寒O-SP多糖结合疫苗在小鼠体内具有很强的免疫原性，可刺激小鼠产生很强的抗体，而单独的O-SP多糖不能刺激小鼠产生抗体或仅有低水平抗体。且乙型副伤寒O-SP多糖与甲型副伤寒O-SP多糖差异微小，仅存在一个不同的抗原位点，为了制备仅识别乙型副伤寒O-SP多糖的单克隆抗体，本专利技术申请人利用乙型副伤寒O-SP多糖结合疫苗免疫小鼠使之能产生高水平抗体，采用小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合技术获得杂交瘤细胞，并通过排除法筛选出特异性识别特定抗原位点的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，然后通过单克隆抗体来检测乙型副伤寒O-SP多糖结合疫苗的多糖含量，不与甲型副伤寒O-SP多糖、甲型副伤寒O-SP多糖结合物等发生交叉反应。本专利技术还提供所述抗乙型副伤寒O-SP的单克隆抗体的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：步骤(1)第一次筛选：将乙型副伤寒O-SP多糖结合疫苗免疫小鼠，分离小鼠的脾脏细胞，并将小鼠脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0融合，融合后的细胞分配到多孔饲养细胞板中培养，分别取细胞板中的细胞上清液检测抗体，采用ELISA方法筛选出产生抗乙型副伤寒O-SP抗体的杂交瘤细胞株；步骤(2)第二次筛选：将乙型副伤寒O-SP、乙型副伤寒O-SP结合疫苗、破伤风类毒素蛋白、甲型副伤寒O-SP分别包被板，分别取筛选出杂交瘤细胞株的上清液，采用ELISA间接竞争法筛选杂交瘤细胞阳性孔，最后筛出特异性识别抗乙型副伤寒O-SP的杂交瘤细胞株，克隆该杂交瘤细胞株，产生特异性识别抗乙型副伤寒O-SP，同时不和甲型副伤寒O-SP、破伤风类毒素载体蛋白的单克隆抗体产生反应。步骤(1)ELISA间接竞争法通过检测细胞上清液时检测A450值进行判断是否存在抗体。步骤(2)ELISA间接竞争法检测杂交瘤细胞株的上清液时检测A450值，以检测值/阴性值>2.1的孔判断为阳性孔，即为乙型副伤寒O-SP的杂交瘤细胞株。ELISA方法中以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体作为酶标二抗。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、与传统的化学基团检测相比，避免了实验过程操作复杂、以及试验过程中强酸强碱的使用带来的危险因素，检测过程更为简便、直观；2、与传统的化学基团检测如O-乙酰基、蒽酮法相比，本专利技术能 特异的从含有甲型副伤寒O-SP的疫苗溶液中将乙型副伤寒O-SP的含量测定出来。3、与传统的化学基团检测相比，化学基团检测为一种非活性检测而利用本专利技术检测为一种活性检测，能真实反映抗原的免疫原性。4、应用本单克隆抗体进行乙型副伤寒O-SP的含量检测的灵敏度与传统方法检测灵敏度微克级相比，灵敏度可以达到纳克级，具有操作简单，特异性强，高通量的特点；5、本专利技术制得的单克隆抗体纯度高，抗体滴度高，符合后续实验要求，本专利技术运用单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法测定乙本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌抗乙型副伤寒O‑SP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞命名为WV‑SPB‑11，保藏编号：CCTCC NO:C2015228。
【技术特征摘要】
1.一种分泌抗乙型副伤寒O-SP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞命名为WV-SPB-11，保藏编号：CCTCC NO:C2015228。2.一种抗乙型副伤寒O-SP的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1中的杂交瘤细胞株分泌。3.如权利要求2所述的抗乙型副伤寒O-SP的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体以乙型副伤寒O-SP多糖结合疫苗免疫小鼠后制备得到。4.如权利要求3所述的抗乙型副伤寒O-SP的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体制备过程采用ELISA间接竞争...
【专利技术属性】
技术研发人员：钱雯，倪萍，黄薇，吴俊波，熊应景，王丽丽，陈玉秋，陈敏，施競，陈燕，杨晨，
申请(专利权)人：云南沃森生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53
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