本发明专利技术公开了一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，在洗净的金电极上滴加捕获探针，冰箱中过夜后取出封闭，在金电极上滴加待测样品，反应完后再滴加环化DNA，反应，滚环扩增，再加入金纳米探针，杂交，进行DPV信号检测。本发明专利技术选用沙门菌高度保守的invA基因，设计与其特异性结合的探针，结合滚环扩增与金纳米技术，利用电化学技术检测沙门菌invA基因，灵敏度上有了极大的改善，使得检测的线性范围达到100aM～10pM，灵敏度为：100aM。污染牛奶中沙门菌检测范围为20～6×108CFU?mL-1的沙门菌，最低检测限为20CFU?mL-1。本发明专利技术构建了快速和超灵敏检测沙门菌的方法，极大提高了检测的灵敏度，具有检测设备小型化、简便快速和检测成本低的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种沙门菌基因的检测方法，尤其涉及一种，属于生物检测领域。
技术介绍
沙门氏菌属肠杆菌科，是革兰阴性肠道杆菌，它是食源性疾病中最重要的致病菌之一。沙门氏菌感染后主要引起食物中毒、胃肠炎、伤寒和副伤寒。有研究表明，沙门氏菌的侵袭蛋白与其致病性密切相关，决定着细菌进入宿主上皮细胞的能力。它主要由一系列基因编码，其中invA是编码沙门菌侵染上皮细胞表面蛋白的基因，与该菌致病性密切相关，是沙门菌特有的。目前，最常用的肠道致病菌检测方法主要有三种:传统的分离培养鉴定、酶联免疫吸附法(ELISA)和聚合酶链式反 应(PCR)。传统的分离培养鉴定法是将细菌分离培养后通过菌落计数和菌落形态、染色特征、生化反应等方法对细菌进行鉴定，该方法是细菌鉴定的金标准方法，但是其耗时费力。ELISA方法是基于抗原抗体反应的免疫学检测，与传统的分离培养鉴定方法相比较，缩短了检测时间，但是仍然需要细菌培养这一步，至少需要24~48小时才能得出准确的结果，而且该方法的检测限一般为> IO5CFU mL—1，难以满足低浓度细菌的检测。PCR技术与上述两种方法相比较，优点是较高的灵敏度，但是PCR结果容易出现假阳性；目前实验室主要用凝胶电泳技术来检测PCR扩增的片段，但是凝胶电泳技术的分辨率较低且需要较高精确度的热循环仪，因此限制了 PCR技术在实验室检测细菌的广泛运用。另一方法，不使用热循环仪的核酸依赖的扩增(NASBA)和自主序列复制系统(ASR)，在特异性上又大打折扣，主要是由于必须用一个相对较低的温度40°C来进行扩增。链置换扩增术(SDA)利用四种引物在等温条件下扩增，很大程度上克服了这些缺陷，但是仍然存在薄弱的环节:必须利用昂贵的修饰核苷酸作为底物来进行扩增反应。生物学研究领域中经常遇到一些不能直接扩增的待测分子，且由于其浓度较低而无法检测，因而信号放大技术对不能进行直接扩增的低浓度待测分子的检测显得尤为重要。核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段，如用于病毒检测和遗传病点突变检测方面的连接酶链式反应(LCR)、支链DNA信号放大系统(bDNA)和侵染探针技术(Invader)；用于快速准确检测和定量分析RNA的NASBA和转录介导的扩增(TMA);用于检测目的DNA片段的Qi3复制等。目前为止，聚合酶链式反应(PCR)和滚环扩增(rolling circleamplification, RCA)仍是使用较多的扩增技术。RCA是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在酶催化下将dNTPs转变成单链DNA，此单链DNA包含成百上千个重复模板片段。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。RCA技术的优势是:高灵敏度、高特异性、简单、易操作、多元性、高通量。纳米颗粒是一种人工合成的微小颗粒，它的形态可能是乳胶体、聚合物、陶瓷颗粒、金属颗粒和碳颗粒。1996年，Mirkin等人(Mirkin, C.A., et al ；)发现表面修饰有核酸探针的13nm金颗粒溶液中加入与修饰核酸互补配对的目标核酸分子时，由于金颗粒聚集导致溶液的颜色由红变蓝。自此利用纳米颗粒来进行生物分子检测的研究得到广泛应用。目前通用的方法主要分为两种，一种是利用在金或银纳米颗粒修饰核酸探针，根据溶液的颜色变化来检测目标核酸分子，优点是检测方法简单，但是所用的纳米颗粒成本较高?’另一种是利用在颗粒表面修饰核酸分子，通过不同的核酸扩增手段后加入荧光探针来进行目标分子检测，优点是检测的灵敏度高，但是荧光探针的成本也较高。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于构建快速和超灵敏检测沙门菌invA基因的方法，选用沙门菌高度保守的invA基因，设计与其特异性结合的探针，利用滚环扩增与金纳米技术，用电化学策略检测沙门菌，提供一种检测设备小型化、简便快速、灵敏度高、检测成本低的检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是:一种，包括以下步骤:1)将裸金电极抛光，洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10~15min，再取出清洗、干燥；2)将巯基标记的捕获探针滴加于上述金电极上，置于4°C冰箱中过夜；3)将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭I~1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极30~40min ；4)将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加待测样品溶液，37°C反应I~1.5h，然后在金电极上滴加提前制备好的环化DNA，37°C反应I~1.5h ;5)将步骤4中的金电极取出冲洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37 °C滚环扩增I~1.5h ;6)将步骤5中的金电极取出冲洗，加入用2XSSC杂交液配制的金纳米探针，37°C杂交I~1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；7)在步骤6中的金电极上加入用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP，37°C反应30~45min，用DEA缓冲液冲洗后，置入用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL的α -NP底物溶液中进行差动脉冲伏安法DPV信号检测，所得信号用标准曲线法或标准对照法即可得到待检样品中沙门菌的浓度。所述步骤I中金电极抛光用粒度为0.05 μ m的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H2SO4IH2O2体积比为3:1的溶液。所述的巯基标记的捕获探针序列为:5’ -SH-(CH2)6- TTTTTTTTTAATACCGGCCTTCAAATCGGCATC-3’，用于制备金纳米探针的用巯基标记的信号探针序列为:5’ -SH-(CH2)6-TTTTTTTCAGAACTCACCTGTTAGTTTTTT-biotin-3’，制作环化模板 DNA 时所用的待环化模板 DNA 序列为:5’ -p-CTCAGCTGTGTAA CAACATGAAGATTGTAGGTCAGAACTCACCTGTTAGAAACTGTGAAGATC GCTTATTATG TCCTATC-3'，探针 2 序列:5’ - AATACTCATCTGTTTACCGGGCA TAAAAAAAAACACAGCTGAGGATAGGACAT-3，。所述步骤3至6中金电极的冲洗按照如下步骤完成:先用含0.005%吐温20的Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次，Tris-HCl缓冲液为含有0.1M 氯化钠、5mM 氯化镁、20mM Tris-HCl, ρΗ7.4。所述步骤3中的鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按浓度为10mg/ml的鲑鱼精DNA与2%BSA体积比为1:80混合配制。所述步骤5中的滚环扩增反应液中含50mM Tris, IOmM氯化镁，33mM醋酸钾，ImM二硫苏糖醇，0.1%吐温-20，pH7.5。所述步骤6中的2 X SSC杂交液含有0.3M氯化钠，0.03M柠檬酸三钠，pH7.4 ;所述DEA缓冲液为含有0.1M 二乙醇胺，ImM氯化镁，IOOmM氯化钾，pH9.6。该方法沙门菌特异性的invA基因检测的线性范围为IOOaM~ΙΟρΜ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，包括以下步骤：1）将裸金电极抛光,洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10～15min，再取出清洗、干燥；2）将巯基标记的捕获探针滴加于上述金电极上，置于4℃冰箱中过夜；3）将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6?巯基?1?己醇封闭1～1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极30～40min；4）将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加待测样品溶液，37℃反应1～1.5h，然后在金电极上滴加提前制备好的环化DNA，37℃反应1～1.5h；5）将步骤4中的金电极取出冲洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37℃滚环扩增1～1.5h；6）将步骤5中的金电极取出冲洗，加入用2×SSC杂交液配制的金纳米探针，37℃杂交1～1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；7）在步骤6中的金电极上加入含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25μg/mL的ST?AP，37℃反应30～45min，用DEA缓冲液冲洗后，置入用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL的α?NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，所得信号用标准曲线法或标准对照法即可得到待检样品中沙门菌的浓度。...
【技术特征摘要】
1.一种基于滚环扩增和金纳米对沙门菌irwA基因检测的方法，包括以下步骤: 1)将裸金电极抛光，洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10~15min，再取出清洗、干燥； 2)将巯基标记的捕获探针滴加于上述金电极上，置于4°C冰箱中过夜； 3)将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭I~1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极30~40min ； 4)将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加待测样品溶液，37°C反应I~1.5h，然后在金电极上滴加提前制备好的环化DNA，37°C反应I~1.5h ; 5)将步骤4中的金电极取出冲洗，加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37°C滚环扩增I~1.5h ; 6)将步骤5中的金电极取出冲洗，加入用2X SSC杂交液配制的金纳米探针，37°C杂交I~1.5h，用DEA缓冲液清洗电极； 7)在步骤6中的金电极上加入含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP，37°C反应30~45min，用DEA缓冲液冲洗后，置入用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL的α -NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，所得信号用标准曲线法或标准对照法即可得到待检样品中沙门菌的浓度。2.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述步骤I中金电极抛光用粒度为0.05 μ m的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H2SO4 = H2O2，体积比为 3:1。3.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和金纳米对沙门菌invA基因检测的方法，其特征在于:所述的巯基标记的捕获探针序列为:5 ’ -SH- (CH2) 6 - TTTTTT TTTAATACCGGCCTTCAAATCGGCATC-3’，用于制备金纳米探针的用巯基标记的信号探针序列为:5’ -SH-(CH2) 6-TTTTTT...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁世家，周钦，李剑波，程伟，颜玉蓉，朱丹，申波，雷品华，张伟，李佳迅，董芳，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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