重组鸡白痢沙门菌、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种重组鸡白痢沙门菌、制备方法及应用，属于动物细菌基因工程技术领域。重组鸡白痢沙门菌的名称为鸡白痢沙门菌C79-13ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)，保藏编号：CCTCC NO:M 2015305，其表达的鸡新城疫病毒保护性抗原基因-HN基因是鸡新城疫病毒重要的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保护性。重组菌株衍生于鸡白痢沙门菌标准菌株C79-13，完全保留了C79-13针对鸡白痢沙门菌的免疫效力，且其毒力比C79-13更弱，具有良好的生物安全性，可同时提供针对鸡白痢沙门菌和鸡新城疫两种病原的保护力。同时，该重组菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及一种重组鸡白频沙口菌，具体设及一种不含抗性标记的表达鸡新城疫 病毒主要保护性抗原的减毒鸡白频沙口菌，W及该重组鸡白频沙口菌的制备方法和应用， 属于动物细菌基因工程

技术介绍
沙口菌（Salmonella)是一种胞内寄生的革兰氏阴性肠道杆菌，具有侵袭性。最常 见的沙口菌属有鼠伤寒沙口菌、猪霍乱沙口菌、肠炎沙口菌和鸡白频沙口菌等。沙口菌对人 和动物均有较强的致病力，可引起人体和动物的胃肠道疾病，沙口菌在外界环境中的生存 力较强，在利用基因工程的方法致弱后，仍具有较强的侵袭力。 最初预防沙口菌的疫苗为全菌体灭活苗，但该类疫苗只能激发机体的体液免疫， 且容易引起副作用，此外，还存在需多次免疫及无交叉保护等不足之处，因而不能广泛应 用。此后，该领域众多学者模拟沙口菌肠道自然感染的方式，给动物口服减毒沙口菌，结果 发现，可诱导机体产生更好的体液免疫和细胞免疫，因此该方法受到众多学者的普遍重视 (Li,Q. ,Hu,Y. ,Xu,Y. ,etal. . 2014.Ageneknock-inmethodusedtopurifyplasmid pSPI12fromS过lmonell过enteric过serov过rPulloruma打dchar过cteriz过tionofIp过J.J MicrobiolMethods, 98, 128-133.)O 由于肠炎伤寒沙口菌Ty21a及猪霍乱沙口菌疫苗菌株巧00的致弱背景不清 晰，各国研究者们尝试应用基因工程的方法，研究遗传背景清晰的伤寒减毒基因缺失疫 苗株，用于口服免疫研究，例如巧a/c;rp缺失株（Qi;rtissR,Goldschmi化RM,Fletchall NB,etal. 1988.AvirulentSalmonellatyphimuriumdeltacyadeltacrporal V曰ccinestr曰insexpressing曰streptococc曰Icoloniz曰tion曰ndvirulence antigen,Vaccine, 6(2):155-60.)、asd基因缺失株（GalcSnJE,化kayamaK,Qi;rtissIII R.CloningandcharacterizationoftheAasdgeneofSalmonellatyphimurium:use inst曰blemaintenanceofrecombin曰ntplasmidsinS曰lmonell曰vaccinestr曰ins. Gene, 1990,94(1) :29-35.)等。 减毒沙口菌除本身可作为疫苗外，也可作为载体来表达外源抗原基因。近年 来，W减毒沙口菌为载体表达肿瘤、病毒、细菌、寄生虫等的外源保护性抗原基因，研制多 联基因工程疫苗已成为该领域的研究热点，为研制新型基因工程疫苗开辟了新的途径 (李正，程相朝.减毒沙口氏菌在疫苗和疫苗载体方面的研究进展.中国畜牧兽医， 2012,Ol:40-44)OW减毒沙口菌为载体的基因工程疫苗的优越性主要表现在（胡娇.猪霍乱沙 口菌巧00Aasd缺失株的构建及其作为疫苗活载体的初步应用巧].扬州大学，2010; Xu,F. ,Ulmer,J.B. 2003.AttenuatedsalmonellaandShigellaascarriersforDNA vaccines.JDrugTarget, 11(8-10):481-488.)： (I)能入侵机体的淋己免疫系统，有效刺激机体的体液免疫及细胞免疫； (2)既可携带原核重组表达质粒也可携带真核重组表达质粒； (3)可通过口服、鼻内接种等自然感染途径，刺激黏膜淋己细胞产生分泌型IgA， 形成保护屏障，防止经黏膜感染的微生物对宿主细胞的侵袭及定殖； (4)减毒沙口菌本身具有免疫佐剂的功能，免疫时无需加入额外的免疫佐剂，其脂 多糖（LP巧是内在佐剂，LPS可刺激机体产生多种细胞因子，增强DC捕获并加工M肥-I类 抗原的能力，有助于进一步将抗原呈递给特异性淋己B、T细胞； (5)免疫具有持续性，减毒沙口菌入侵机体后，可在宿主体内生存并有限繁殖，因 其已被减毒，最终可被宿主清除，只要减毒沙口菌在宿主体内存活，其重组质粒表达的外源 蛋白就能对宿主产生连续性的刺激，从而省去了多次加强免疫所带来的麻烦； (6)可将多种病原的不同保护性抗原基因或同种病原的不同抗原基因同时串联至 表达质粒上，产生针对多种抗原的免疫反应，从而起到一种疫苗预防多种疾病的目的； (7)重组减毒沙口菌疫苗表达的抗原蛋白不需要在体外提纯，减少了疫苗生产及 加工处理程序，且易于储存和运输，疫苗成本较低； (8)该疫苗接种方式简单，易于大规模接种，接种后可稳定表达外源基因。 鸡白痴沙口菌（SalmonellaenteriaserovarPullorum,S.Pullorum)是引起鸡 白痴的宿主特异性致病菌，多侵害20日龄W内维鸡，发病率和致死率都很高。由于该菌能 水平传播和垂直传播，给家禽养殖业带来严重的经济损失，中国农业部将其列为二类疫病。 疫苗免疫预防被认为是防控该病的有效手段。近年来，人们对通过基因工程技术使沙口菌 毒力减弱，进而将减毒沙口菌作为疫苗或疫苗活载体的途径愈感兴趣。沙口菌通过基因工 程的方法减毒后，其对宿主的致病性大大降化，但仍可保留良好的侵袭力和免疫原性（Xin Zhang,SandraM.Kelly,WendyBollen,民oyCurtissIII.1999.Protectionandimmune responsesinducedbyattenuatedSalmonellatyphimuriumUK-1strains.Microbial Pathogenesis, 26 (3) : 121 - 130.)O 黏膜免疫与多价疫苗是未来免疫预防传染病的重要方向，W细菌为载体的重组 活疫苗是最有发展前景的研究领域之一，特别是W减毒沙口氏菌作为活疫苗表达载体 的研究更是受到 了广泛的关注（GengS.，Jiao,X.，Barrow,P.etal.?2014.Virulence determinantsofSalmonellaGallinarumbiovarPullorumidentifiedbyPC民 sig打过ture-t过ggedmut过genesis过ndthespiCmut过nt过s过c过ndid过telive过ttenu过ted vaccine,VetMicrobiol, 168 (2-4) : 388-394)D沙口氏菌属侵袭性胞内菌，可将外源质 粒DNA直接呈递给抗原递呈细胞（APC)，携带质粒DNA的细菌在APC细胞内发生溶解或W 宿主吞瞻小体进入胞质，并将DNA释放到细胞核，从而使抗原基因在体内进行表达，并诱 导相应的细胞免疫和体液免疫反应脚iam, 0?比，McSorley,S.J. 2015.^Protectivehost immuneresponsestoSalmonellainfection.FutureMicrobiology,10(I):101-110 ; Duerkop,B.A.，Vaishnava,S.，Hooper,LV. 200本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组鸡白痢沙门菌，其特征在于：其为鸡白痢沙门菌C79‑13ΔcrpΔasd(pYA3493‑HN)，保藏编号：CCTCC NO:M 2015305。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郁川，程相朝，余祖华，翟崇凯，何雷，贾艳艳，廖成水，李静，汪洋，张春杰，李银聚，吴庭才，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41