本发明专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒。所述试剂盒中包括tcpS基因检测引物、lygD基因检测引物和flhBinner基因检测引物。本发明专利技术的试剂盒能快速高通量分别鉴定肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林沙门菌血清型，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为这三种特定血清型沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、重复性好的新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒。
技术介绍
沙门菌病是公共卫生学上有重要意义的人兽共患病之一，其病原沙门菌属于肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品是主要传播媒介，它不但可引起多种畜禽疾病，造成全身性败血症和肠炎，还可以作为食源性疾病的病原体，引起人类胃肠炎和食物中毒。在我国，细菌性食物中毒中，约有70％～80％是由沙门菌引起的。目前，根据Kauffman-White(K-W)血清型分型方法，依据沙门菌菌体抗原及鞭毛抗原的不同，沙门菌目前的血清型有2600种以上，中国已报道了292种不同的血清型，分属于35个O群。传统的检测方法即非选择性和选择性增菌、生化特性及血清学鉴定很费力、耗时，需4-7天才能完成，其它如抗体检测法，虽然快速，但其高假阳性使之不适于常规检测。此外，低水平的病原菌污染，食品加工后导致沙门菌的“致伤”及食品其它成分的干扰等因素，使得沙门菌的检测受到一些限制。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法，以及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。
技术实现思路
针对现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒及其制备和应用。为了实现上述目的及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括tcpS基因检测引物、lygD基因检测引物和flhBinner基因检测引物。优选地，所述tcpS基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。优选地，所述lygD基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。优选地，所述flhBinner基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物。本专利技术的试剂盒采用多重PCR检测技术进行tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断检测对象是否属于肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌或者都柏林沙门菌之一。因此，引物的设计是本专利技术试剂盒的关键。基于本专利技术所述试剂盒是采用PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：无菌水(ddH2O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。本专利技术的试剂盒，可以是含有独立包装的引物对，也可以是含有配置好的含有引物对的PCR检测液。所述PCR检测液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR检测液加入引物获得。例如，所述试剂盒中还可以含有无菌水(ddH2O)、dNTP、PCR buffer、rTaq酶。加入本专利技术的引物、待检样本DNA提取物或者样本菌液即可获得PCR反应体系。优选地，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有tcpS基因、lygD基因或flhBinner基因表达的DNA样本。优选地，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为无tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因表达的DNA样本。本专利技术的第二方面，提供了前述多重PCR检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)提取样品基因组DNA；(2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因检测引物；(3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；(4)PCR反应结束后，分析结果。优选地，所述方法为非疾病诊断目的的方法。步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：(a)94℃5min；(b)94℃45s；(c)55℃45s；(d)72℃40s，步骤(b)～(d)循环30次，(e)72℃10min。本专利技术的第三方面，提供了前述试剂盒在制备tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因检测产品中的用途。优选地，所述检测产品用于分别检测和筛选肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌或者都柏林沙门菌。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术通过广泛而深入的研究，首次发现tcpS基因仅存在于肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林这三种血清型沙门菌中，lygD基因仅存在于肠炎沙门菌中，而鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因相较于其它血清型沙门菌flhB缺少中间的核苷酸片段，因而，以三对特异性引物通过PCR技术验证了tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因在不同血清型沙门菌及其它细菌中的分布。本专利技术的试剂盒能快速高通量分别鉴定肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林血清型沙门菌，可作为沙门菌传统血清学分型的辅助方法，并为这三种特定血清型沙门菌的监测与实验室诊断提供了一种简单快速、重复性好的新方法。附图说明图1：为利用tcpS基因、lygD基因和flhBinner基因区分肠炎沙门菌、鸡白痢和鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的示意图；其中，tcpS基因仅存在于肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林这三种血清型沙门菌中，lygD基因仅存在于肠炎沙门菌中，而鸡白痢和鸡伤寒沙门菌flhB基因相较于其它血清型沙门菌flhB缺少中间的核苷酸片段(flhBinner)，即鸡白痢/鸡伤寒沙门菌不能扩增出flhBinner片段。图2：为多重PCR鉴定tcpS基因、lygD基因和flhBinner片段在不同血清型沙门菌和其它细菌中的分布和片段大小图片；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道C50041和C50336：tcpS基因(882bp)、lygD基因(339bp)、flhBinner片段(155bp)；泳道S06004、9855和SG9：tcpS基因；泳道SL5928：tcpS基因、flhBinner片段；C50041和C50336为肠炎沙门菌，S06004和6508为鸡白痢沙门菌，SG9为鸡伤寒沙门菌，SL5928为都柏林沙门菌，T3为乌干达沙门菌，T9为火鸡沙门菌，T8为鸭沙门菌，G2为伦敦沙门菌，ZX为罗森沙门菌，Y7为德尔卑沙门菌，Y8为鼠伤寒沙门菌，C500为猪霍乱沙门菌；H37Rv为结核分枝杆菌，11168和110为空肠弯曲菌，S19为布鲁氏菌，EGDe和JS15为李斯特菌，1314和1352为大肠杆菌。图3：为鉴定肠炎、鸡白痢/伤寒和都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒灵敏度；其中，泳道M为：DL2000Marker；泳道1、4、7、10、13、16为肠炎沙门菌C50041基因组，泳道2、5、8、11、14、17为鸡白痢沙门菌S06004基因组，泳道3、6、9、12、15、18为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括tcpS基因检测引物、lygD基因检测引物和flhBinner基因检测引物。
【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定肠炎沙门菌、鸡白痢/鸡伤寒沙门菌以及都柏林沙门菌的多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括tcpS基因检测引物、lygD基因检测引物和flhBinner基因检测引物。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述tcpS基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述lygD基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物。4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述flhBinner基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物。5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有无菌水、dNTP、PCR buffer、rTaq酶、样品基因组DNA提取试剂中的一种或多种。6...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，潘志明，熊丹，宋丽，焦扬，安树敏，耿士忠，孙林，陈祥，黄金林，殷月兰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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