鼠伤寒沙门菌UF110lux及其在活体成像中的应用，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年3月13日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.5893。鼠伤寒沙门菌UF110是将毒力质粒上spv基因敲除的菌株，可作为对照用于研究鼠伤寒沙门菌毒力基因spv的功能。UF110lux是在其基础上构建的具有稳定生物发光性能的菌株。弥补了传统荧光标记的不足，结合利用活体成像仪器可实时动态地续监测鼠伤寒沙门菌在小鼠活体内的入侵、增殖及扩散情况。为鼠伤寒沙门菌致病机制的深入研究提供便利的工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物
，特别涉及鼠伤寒沙门菌UFllOlux及其在活体成像中的应用。
技术介绍
鼠伤寒沙门菌{Salmonella typhimurium)宿主范围广泛,感染发病率高,是目前食品安全、农业、畜牧业和医学领域研究的热点。沙门菌质粒毒力基因5/^ (Salmonellaplasmid virulence genes)是沙门菌毒力质粒上的的高度保守序列。编码的产物和细菌 的毒力表型关系最为密切，能增加沙门菌在肠外组织细胞内的增值，并与细菌血清抗性、粘附与定居有关；另外5/^基因还可影响细菌在胞内存活和宿主细胞的自噬凋亡。UFllO是鼠伤寒沙门菌毒力质粒上^敲除的菌株，可作为对照用于研究鼠伤寒沙门菌毒力基因SPV的功能。近年来，活体动物体内光学成像技术以其操作简便及直观性在生命科学研究中得以不断发展。这种成像技术可以直接实时观察标记的基因及细胞在活体动物体内的活动及反应。利用光学标记的细菌建立动物模型可以实时动态追踪病原菌在动物活体内的感染过程，深入研究病原菌致病机制，进行药物研究及筛选等。生物发光技术是目前活体成像研究的热点，它是用荧光素酶(Iuciferase)基因标记。以荧光素酶作为体内报告源的生物发光是以酶和底物的特异作用而发光，特异性极强，因动物本身没有任何自发光，使得生物发光相较传统的荧光技术具有极低的背景，极高的信噪比。细菌荧光素酶基因操纵子ZmCDABE由荧光素酶基因和其底物合成酶基因组成，其标记的细菌会持续发光不需要外源性底物。近年来研究者们陆续将其克隆至多种载体导入病原菌中，应用生物发光技术和小动物成像系统监测病原菌感染过程。但以质粒为基础的生物发光技术在无抗生素选择下不稳定，不能用于体内的长期研究。对实验小鼠注射抗生素来筛选携带完整发光质粒的沙门菌，会造成小鼠的耐药性，且会在某种程度上干扰实验结果。又因质粒的拷贝数不同，单细胞发光强度不稳定，无法以发光强度来定量检测病原菌。2010年，Kevin Howe构建质粒pBEN276，利用该质粒可将Lux操纵子克隆至细菌染色体(图1)，其生物发光信号可以用于精确定量，本专利技术由此在鼠伤寒沙门菌UFllO基础上构建了具有稳定生物发光性能的菌株UFllOlux，可作为对照在动物活体内实时观察5/^基因对细菌致病过程的影响。
技术实现思路
解决的技术问题本专利技术针对荧光标记的体内检测特异性低，背景高，难定量等缺陷，及以往以基于质粒的生物发光检测需外加筛选压力和底物，且难以定量等不足，提供了一种可以稳定发光的鼠伤寒沙门菌UFlIOlux及其在活体成像中的应用。技术方案 鼠伤寒沙门菌typhimurium) UFl IOlux,该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年3月13日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 5893。鼠伤寒沙门菌typhimurium) UFlIOlux在活体成像中的应用。鼠伤寒沙门菌(5^7^9/7(9773UFllO下文简称UFllO ;鼠伤寒沙门菌{Salmonella typhimurium) UFIlOlux 下文简称 UFIlOlux。 有益效果该鼠伤寒沙门菌具有稳定的生物发光性能，弥补了生物荧光的细菌检测需激发光源且在体内特异性低，背景高，难定量等缺陷。经位点特异性重组，将管家基因E. coli /rr启动子和操纵子插入宿主菌染色体中稳定表达(同时插入位点不破坏基因组基因功能，对细菌无不利影响)。操纵子在其上游连接的管家基因E.co7i /rr启动子的调控下，组成性表达荧光素酶和底物，无需外加筛选压力和底物维持细菌发光。并通过实验检测到细菌的数量与其发光强度成正比，且在小鼠活体内能持续检测到细菌的生物发光。弥补了以往质粒标记的生物发光细菌需外加筛选压力和底物，影响发光检测，且单位细胞发光量不稳定等不足之处。荧光酶基因插入染色体中稳定表达，单位细胞的发光数量很稳定。加上生物发光技术极高的特异性和信噪比，即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。可广泛应用于体外细胞感染模型和体内实验动物模型的建立。结合利用活体成像仪器可实时动态的持续监测鼠伤寒沙门菌在小鼠活体内的入侵、增殖及扩散情况。为鼠伤寒沙门菌及伤寒沙门菌致病机制的深入研究，药物研究和筛选及相关疾病防治策略的研究等提供便利的工具。附图说明图I为PBEN276质粒图谱，tnsABCD为编码Tn7转座子的基因。操纵子IuxCDABE编码荧光素酶和底物，引入多克隆酶切位点Xhol和Notl，将其连接于Tn7转座子侧翼。Lux操纵子3’端连接Ε. coli管家基因frr的启动子，启动Zm操纵子的组成性表达。图2为菌落生物发光检测结果(I和2依次为UFllOlux单菌落在whitelight和luminescence条件下成像，3和4依次为UFllO单菌落在whitelight和luminescence条件下成像)。图3为菌液光子数与细菌数关系的检测结果(I飞UFllOlux菌量倍增；6 =UFllO阴性对照)。图4为光子数与细菌数关系图。图5UF1101ux生物发光稳定性检测结果。图6为稳定发光菌在活体内(麻醉后观察小鼠)脏器的定位(1，2，3依次为将感染UFllOlux的小鼠解剖后，取其脏器于white light模式成像，luminescence模式成像和merge 图像)。具体实施例方式实施例I 菌株具体构建及鉴定 I、材料准备 I.I质粒与菌株 质粒PBEN276由法国自然资源研究所动物传染病和公共健康病原菌研究实验室Pierre Germon 教授惠赠。Kevin Howe, Attila Karsi, Pierre Germon, et. al.Development of stable reporter system cloning luxCDABE genes into chromosome ofSalmonella enterica serotypes using Tn7 transposon . BMC Microbiology 2010,10:197 鼠伤寒沙门菌{Salmonella typhimurium) UFllOlux由美国亚利桑那州立大学生物科学学院 ROY CURTISS III 教授惠赠。HIDEN0RI MATSUI, CHRISTOPHER M. BACOT, WENDYA. Virulence Plasmid-Borne spv^ and spvC Genes Can Replace the 90-KilobasePlasmid in Conferring Virulence to Salmonella enterica Serovar Typhimurium inSubcutaneously Inoculated Mice. Journal of bacteriology, 2001，15(183):4652 - 4658. 1.2仪器与试剂 仪器电转仪(Bio-RadGene Pulser II system)为美国 Bio-Rad 产品； 高速冷冻离心机Beck本文档来自技高网...
【技术保护点】
鼠伤寒沙门菌(Salmonella？typhimurium)？UF110lux，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年3月13日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC？No.5893。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶颖，吴淑燕，李嫄渊，黄瑞，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：
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