布鲁氏菌的检测方法、试剂盒及其应用技术

本申请公开了布鲁氏菌的检测方法,包括如下步骤：采用离心柱法从血清标本中获取布鲁氏菌DNA，获得待测样本；PCR扩增反应；采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV‑FP 5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号；对结果分析。本申请还提供一种检测布鲁氏菌的试剂盒。本发明专利技术的检测方法、试剂盒敏感性高，最低检出可达到1000copies/mL；同时，本发明专利技术的检测方法的特异性很好，不和其他的细菌发生交叉反应，例如大肠杆菌、肠炎沙门菌、乙型肝炎病毒、人类疱疹病毒4型、人巨细胞病毒等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细菌的检测方法、试剂盒及其应用，具体讲，涉及一种布鲁氏菌的检测方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，又称地热中海弛张热、马耳他热或波浪热，俗称“懒汉病”，是由细胞内寄生的布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起的一种人兽共患传染—变态反应性疾病，布病广泛分布于世界各地。目前已知有60多种家畜、家禽、野生动物是布鲁氏菌的宿主。与人类有关的传染源主要是羊、牛及猪，其次是犬。病畜的分泌物、排泄物、流产物及乳类含有大量病菌，在动物间传播，造成带菌或发病。人通过接触布病感染的动物、食用布鲁氏菌污染的奶制品以及实验室接触等传播方式引起布菌感染。布鲁氏菌为小球杆状菌，革兰氏染色阴性，无鞭毛，不形成芽孢，一般无荚膜，毒力菌株可有微薄的荚膜。本菌侵入人体后，随淋巴液到达淋巴结，被吞噬细胞吞噬。如布菌未被吞噬细胞杀灭，则细菌在胞内生长繁殖，形成局部原发病灶。此阶段有人称为淋巴源性迁徙阶段，相当于潜伏期，潜伏期为7-60天，平均两周，少数患者可达数月或1年以上。细菌在吞噬细胞内大量繁殖导致吞噬细胞破裂，随之大量细菌进入淋巴液和血循环形成菌血症。在血液里细菌又被血流中的吞噬细胞吞噬，并随血流带至全身，在肝、脾、淋巴结、骨髓等处的单核—吞噬细胞系统内繁殖，形成多发性病灶，造成临床上不仅有菌血症、败血症，而且还有毒血症的表现。经一定时期后，感染灶的细菌生长繁殖再次入血，导致疾病复发。组织病理损伤广泛。临床表现也就多样化。如此反复成为慢性感染，慢性期多侵及脊柱和大关节，表现为长期发热(包括低热)、多汗、关节痛兼或肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等可疑症状及体征。布鲁氏菌常规检测方法主要有血培养方法和虎红平板凝集试验(RBPT)、血清凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等免疫学方法。血培养中分离到布鲁氏菌仍然是布鲁氏菌病诊断的“金标准”，但布鲁氏菌分离培养的敏感性低、耗时、费力，而且具有较大的生物安全性危害。免疫学方法目前已经用于布鲁氏菌病的监测和流行病学调查研究中，但由于在感染早期，机体还未产生相关抗体或产生的抗体还未达到检测的限度，易得到假阴性结果；而布鲁氏菌与某些细菌间又存在交叉反应，易得到假阳性结果，影响了检测的特异性。随着分子生物学技术的发展，PCR方法已被用于布鲁氏菌病的辅助诊断和病原体的检测鉴别中。但普通PCR却存在着操作步骤繁琐，容易造成污染，难以准确定量检测等不足。因此，在布鲁氏菌感染早期或对药品生物制品中布鲁氏菌检测时，急需建立一种快速、特异、灵敏且高通量检测布鲁氏菌的方法。荧光定量PCR技术是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量检测技术。荧光定量PCR使用了特异性的探针，能够对靶序列进行特异性的识别，具有引物探针双重控制，且综合了荧光标记技术、激光检测技术、数码显像技术，在扩增指数期进行定量，具有很高的特异性、灵敏性，准确性及假阳性率低等特点。本产品采用实时荧光定量PCR技术，用于定量检测人体血清样本中的布鲁氏菌DNA。以布鲁氏菌保守基因序列为检测目的片段，该检测不得作为患者病情单独的评价指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价，还可通过对患者布鲁氏菌DNA基线水平和变化情况的监测，用于评估抗细菌治疗的应答和治疗效果监测。本试剂不用作布鲁氏菌的血源筛查。目前，国内外临床应用上还没有采用荧光定量PCR方法检测布鲁氏菌。使用本专利技术中所提到布鲁氏菌核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)，由于使用离心柱法，可以有效进行核酸提取，在本试剂盒中，我们使用的定量标准品和阳性质控品为灭活菌株或灭活的阳性样本，可以与待测样本同时进行提取与扩增，从而可以全程监控标本提取扩增。
技术实现思路
本申请解决的主要问题是提供一种布鲁氏菌的检测方法及试剂盒，以解决无法实现的技术问题。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了布鲁氏菌的检测方法,包括如下步骤：待测样本获取：采用离心柱法从血清标本中获取布鲁氏菌DNA，获得待测样本；PCR扩增反应：将提取的布鲁氏菌DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增；所述PCR反应混合液，包括：PCR反应液、布鲁氏菌引物探针混合液，所述布鲁氏菌引物探针混合液，包括，上游引物Bcsp-F，下游引物Bcsp-R，Taqman荧光探针Bcsp-FP，纯化水；所述上游引物Bcsp-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；所述下游引物Bcsp-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；所述Taqman荧光探针Bcsp-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列,所述Taqman荧光探针BKV-FP5’端有荧光报告基团，3’端有荧光淬灭基团；结果检测：采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV-FP 5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号；对结果分析。进一步地，所述PCR扩增反应的条件为：37℃2min；95℃3min；94℃15s，60℃35s，10个循环；94℃15s，60℃35s荧光，35个循环；25℃1min。进一步地，，所述BKV引物探针混合液，还包括：内标上游引物，内标下游引物，内标探针。进一步地，所述PCR扩增反应，还包括：平行设置Brucella阴性质控品、Brucella临界阳性质控品、Brucella阳性质控品和Brucella定量标准品I～IV反应组，所述Brucella阴性控品为阴性血清，所述Brucella临界阳性质控品、Brucella阳性质控品的待测模板为灭活菌株或灭活阳性标本，所述Brucella定量标准品I～IV的待测模板为灭活菌株或灭活阳性标本。进一步地，，所述的Taqman荧光探针BKV-FP的荧光报告基团6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5.5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种。进一步地，，所述PCR反应液，包括UDG酶防污染体系，所述UDG酶防污染体系，包括：UDG酶及dUTP。本申请还提供检测布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的上游引物Bcsp-F，下游引物Bcsp-R，Taqman荧光探针Bcsp-FP，纯化水；所述上游引物Bcsp-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；所述下游引物Bcsp-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；所述Taqman荧光探针Bcsp-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。进一步地，该试剂盒还包括：内标上游引物、内标下游引物、内标探针、Brucella阴性质控品、Brucella阳性质控品、Brucella临界阳性质控品和Brucella定量标准品I～IV，所述Brucella阴性质控品为阴性血清，所述Brucella临界阳性质控品、Brucella阳性质控品为灭活菌株或灭活标本，所述Brucella定量标准品I～IV为灭活菌株或灭本文档来自技高网...

【技术保护点】
布鲁氏菌的检测方法,包括如下步骤：待测样本获取：采用离心柱法从血清标本中获取布鲁氏菌DNA，获得待测样本；PCR扩增反应：将提取的布鲁氏菌DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增；所述PCR反应混合液，包括：PCR反应液、布鲁氏菌引物探针混合液，所述布鲁氏菌引物探针混合液，包括，上游引物Bcsp‑F，下游引物Bcsp‑R，Taqman荧光探针Bcsp‑FP，纯化水；所述上游引物Bcsp‑F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；所述下游引物Bcsp‑R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；所述Taqman荧光探针Bcsp‑FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列,所述Taqman荧光探针BKV‑FP5’端有荧光报告基团，3’端有荧光淬灭基团；结果检测：采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV‑FP 5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号；对结果分析。

【技术特征摘要】
1.布鲁氏菌的检测方法,包括如下步骤：待测样本获取：采用离心柱法从血清标本中获取布鲁氏菌DNA，获得待测样本；PCR扩增反应：将提取的布鲁氏菌DNA加到PCR反应混合液中，进行PCR扩增；所述PCR反应混合液，包括：PCR反应液、布鲁氏菌引物探针混合液，所述布鲁氏菌引物探针混合液，包括，上游引物Bcsp-F，下游引物Bcsp-R，Taqman荧光探针Bcsp-FP，纯化水；所述上游引物Bcsp-F包含如SEQ ID NO:1所示的碱基序列；所述下游引物Bcsp-R包含如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；所述Taqman荧光探针Bcsp-FP包含如SEQ ID NO:3所示的碱基序列,所述Taqman荧光探针BKV-FP5’端有荧光报告基团，3’端有荧光淬灭基团；结果检测：采用荧光定量PCR仪检测反应结果，荧光信号收集时设定为Taqman荧光探针BKV-FP 5’端荧光基团对应的荧光素，在60℃收集荧光信号；对结果分析。2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为：37℃2min；95℃3min；94℃15s，60℃35s，10个循环；94℃15s，60℃35s荧光，35个循环；25℃1min。3.根据权利要求1所述的布鲁氏菌的检测方法，其特征在于，所述BKV引物探针混合液，还包括：内标上游引物，内标下游引物，内标探针。4.根据权利要求1所述的BK病毒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应，还包括：平行设置Brucella阴性质控品、Brucella临界阳性质控品、Brucella阳性质控品和Brucella定量标准品I～IV反应组，所述Brucella阴性控品为阴性血清，所述Brucella临界阳性质控品、Brucella阳性质控品的待测模板为灭活菌株或灭活阳性标本，所述Brucella定量标准品I～IV的待测模板为灭活菌株或灭活阳性标本。5.根据权利要求1所述布鲁氏菌的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针BKV-FP的荧光报告基团6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶锋，刘明坤，余荣，
申请(专利权)人：北京旌准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11