一种布鲁氏菌诊断标识作用的基因表达产物BLSJ‑2及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种布鲁氏菌诊断标识作用的基因表达产物BLSJ‑2及其制备方法。该产物是由布鲁氏菌S2株基因编号(GI)为490823642的基因原核表达，并经谷胱甘肽S转移酶(GST)亲和层析柱与谷胱甘肽梯度洗脱法纯化获得。将该产物作为包被抗原，可作为区分动物布鲁氏菌疫苗免疫和自然感染血清检测的诊断抗原。将该抗原分别与疫苗免疫抗体及自然感染抗体进行免疫印迹(Western‑blot)，差异明显。将该抗原作为间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)包被抗原，检测数百份布病临床血清样本，鉴别诊断效果显著。

【技术实现步骤摘要】
一种布鲁氏菌诊断标识作用的基因表达产物BLSJ-2及其制备方法
本专利技术涉及一种布鲁氏菌诊断标识作用的基因表达产物BLSJ-2及其制备方法，属于兽医微生物学诊断领域。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis简称为布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的人畜共患传染病。人感染布病主要来于患病动物及其产品。我国与人类布病有关的传染源主要是患病羊、牛，但以羊种布鲁氏菌危害最为严重(朱良全etal.微生物学通报,2015(01):171～177；吴清民.兽医导刊,2011(09):46～47)。血清学方法是当前诊断动物布病的主要方法，而疫苗接种是预防动物布病的重要手段。布病已有的血清学诊断主要基于检测抗布鲁氏菌脂多糖抗体，由于我国现有动物布病疫苗株(S2、A19和M5)与野毒感染株均属于光滑型菌株，均诱导机体产生抗脂多糖抗体，因而无法通过现有血清学方法区分疫苗免疫和自然感染(毛开荣,等.动物布鲁氏菌病诊断技术.中国农业出版社，2014.)。不过，强弱毒布鲁氏菌感染宿主后的血清学抗体应答出现明显差异，为从血清学上筛选区分自然感染与疫苗免疫的鉴别诊断抗原提供了一些背景和线索。如已有研究表明，强毒感染布鲁氏菌后，7天可检测到抗体，15天抗体水平达到最高，其凝集抗体滴度达到1：3000，随后开始下降，60天后抗体水平已经低于7天时的抗体水平，而240天后抗体为阴性(GaoXL.etalTurkishJournalofVeterinaryandAnimalSciences,2015,39:271～278)。而布鲁氏菌疫苗S2免疫绵羊后，2周后开始检测到抗体，第30天抗体水平达到最高，其滴度为1：120，随后开始下降，至180天后抗体为阴性。上述显示的免疫与自然感染血清之间的差异信息为鉴别诊断点的筛选开辟了新思路。据报道，膜蛋白占据病原微生物总蛋白质的大约30％～40％，不仅是治疗药物和疫苗开发的主要靶点所在，而且含有保护性抗原成分，因而成为布鲁氏菌诊断抗原和药物治疗靶点研究的重点对象(胡剑飞，等.疾病监测,2010(05):380～389；吴朔,等.免疫学杂志,2008(04):385～388)。由于免疫蛋白组学方法可显示蛋白血清学反应差异信息，并可运用生物信息学技术作为高通量筛选的技术平台，从膜蛋白中获取大量可能的鉴别诊断抗原信息，从而破解疫苗免疫与自然感染的难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有血清学方法无法区分布鲁氏菌疫苗免疫抗体和自然感染抗体难题，提供具有鉴别诊断价值的布鲁氏菌基因表达产物，运用免疫学方法，从而实现疫苗免疫抗体及自然感染抗体的鉴别诊断。本专利技术技术方案1.一种布鲁氏菌诊断标识作用基因的表达产物BLSJ-2，其特征在于：该产物是由布鲁氏菌S2株基因编号(GI)为490823642的基因，表达为“糖苷水解酶家族43(glycosidehydrolasefamily43)”；该基因长度：1068bp；其表达产物的蛋白分子量约37.5kDa，其基因序列为基因序列1。2.本专利技术所述的一种布鲁氏菌诊断标识作用基因的表达产物BLSJ-2的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)基因筛选：从布鲁氏菌S2株基因组中，通过免疫蛋白组学方法，筛选鉴定出上述权利1的基因；(2)基因表达：通过设计的引物(序列2和序列3)，经过常规PCR克隆扩增，将其置于pGEX6p-1载体中诱导表达；(3)表达产物纯化：通过谷胱甘肽S转移酶(GST)亲和层析柱与谷胱甘肽梯度洗脱法纯化表达产物，获得所需抗原，被命名为BLSJ-2。3.本专利技术所述的一种布鲁氏菌诊断标识作用基因的表达产物BLSJ-2的应用，其特征在于将该基因PCR克隆扩增，其表达产物作为抗原。该抗原可作为区分动物布鲁氏菌疫苗免疫和自然感染血清检测抗原。本专利技术的详细描述1.鉴别诊断标识基因的筛选(1)采用免疫蛋白组学技术，选择我国应用最广泛的布鲁氏菌疫苗株S2和我国布病影响严重的羊血清为研究对象，从S2株膜蛋白中筛选出鉴别诊断抗原基因信息。(2)各用30份布病阴性健康羊(Nm)、30份S2免疫羊(Sm)，以及30份临床布病感染羊阳性混合血清(Zm)，分别与S2株膜蛋白二维电泳胶(2DE)进行免疫印迹(Western-blot)，寻找S2膜蛋白与不同状态(感染/免疫/阴性)绵羊血清反应差异点，共寻找到113个差异蛋白点。选择免疫反应差异较大的30个蛋白点进行基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱鉴定及生物信息学分析，共鉴定出14个蛋白。(3)将3种混合血清(感染/免疫/阴性)分别与S2膜蛋白进行免疫共沉淀(IP)，并对IP结合物进行高通量质谱鉴定(Q-Exactive质谱仪)及生物学信息分析，获得182个候选蛋白点。对2种方法鉴定出的所有蛋白进行功能分析，共挑选出8个体外鉴别诊断的候选靶点。(4)构建8个候选靶蛋白原核表达质粒，将表达蛋白分别与3种混合血清进行免疫印迹(Western-blot)和酶联免疫吸附测定(ELISA)，筛选到一个具有鉴别诊断效果的基因(糖苷水解酶家族43，glycosidehydrolasefamily43)鉴别诊断效果明显。2.基因产物的表达(1)培养繁殖布鲁氏菌S2株，提取其基因组。(2)以序列2和序列3分别为上下游引物，按常规PCR方法进行基因扩增，上游引物EcoRI:GAATTC为5’-aaGAATTCatgggtttcagccgcaaac-3’27(序列2)；下游引物XhoI:CTCGAG为5’-atCTCGAGtcattttacggtttccgcaag-3’29(序列3)。(3)基因扩增条带，经在1％琼脂糖凝胶电泳中检测片段与预期的大小一致，并将获得的重组质粒送公司测序与美国国家生物技术信息中心(NCBI)上公布的基因序列进行比对，符合率为100％。(4)筛选到的阳性重组质粒转化到商品化的E.coLiBL21(DE3)感受态细胞后，用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，然后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，其重组蛋白分子量大小分别与理论大小基本一致。3.表达产物的纯化(1)诱导表达的蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定为包涵体。(2)将该包涵体经梯度脲素(4.5M、3.5M、2.5M、2M、1.5M、1M、0.5M、0M)的透析复性缓冲液于4℃，按常规方法进行梯度透析复性。(3)运用谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白纯化柱按其说明书方法进行纯化。4.表达产物作为诊断抗原的应用将目的蛋白(糖苷水解酶家族43，glycosidehydrolasefamily43)用谷胱甘肽S转移酶(GST)亲和层析柱纯化后获得的产物命名为BLSJ-2，作为酶联免疫吸附测定法(ELISA)包被抗原，对30份感染血清及656份免疫羊场血清样品进行检测，其建立的酶联免疫吸附测定法(ELISA)对感染样本检出率为87％。附图说明图1S2膜蛋白双相电泳及与不同免疫状态绵羊血清的免疫印迹(Western-blot)结果图中：图A为S2膜蛋白双相电泳结果，图B-D依次为膜蛋白分别与布病阴性健康绵羊混合血清(Nm)、S2免疫绵羊混合血清(Sm)、自然感染绵羊混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种布鲁氏菌诊断标识作用基因的表达产物BLSJ‑2，其特征在于该产物是由布鲁氏菌S2株基因编号(GI)为490823642的基因，表达为“糖苷水解酶家族43(glycoside hydrolase family 43)”；该基因长度：1068bp；其表达产物的蛋白分子量约37.5kDa。其基因序列为序列1.

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏菌诊断标识作用基因的表达产物BLSJ-2，其特征在于该产物是由布鲁氏菌S2株基因编号(GI)为490823642的基因，表达为“糖苷水解酶家族43(glycosidehydrolasefamily43)”；该基因长度：1068bp；其表达产物的蛋白分子量约37.5kDa。其基因序列为序列1.2.如权利要求1所述的一种布鲁氏菌诊断标识作用基因的表达产物BLSJ-2的制备方法，其特征在于：(1)基因筛选：从布鲁氏菌S2株基因组中，通过免疫蛋白组学方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱良全，张磊，王团结，丁家波，冯宇，张阁，彭永，高强，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11