本发明专利技术公开了一种透明质酸酶突变体及其应用，属于酶工程领域。本发明专利技术将透明质酸酶突变体采用食品级安全的工业菌株枯草芽孢杆菌进行表达，获得了透明质酸酶生产菌株。以该重组枯草芽孢杆菌发酵，可在发酵上清液中收集得到透明质酸酶的突变体粗酶液，该酶在pH4～9的范围内保持很好的活性，相比突变前，在耐酸性能上有了提高；在温度25～40℃的条件下能保持很好的活性，相比突变前，在耐受低温的性能上有了显著提高。
Hyaluronidase mutant and application thereof
The invention discloses a hyaluronidase mutant and the application thereof, belonging to the field of enzyme engineering. In the invention, the hyaluronidase mutant is expressed by Bacillus subtilis, a food safety industrial strain, and a hyaluronidase producing strain is obtained. In the fermentation of recombinant Bacillus subtilis, the fermentation supernatant was collected from the crude enzyme liquid mutant hyaluronidase, the enzyme in the range of 9 pH4 to maintain good activity, compared to before the mutation, in acid resistant performance has been improved; a good activity at a temperature of 25 to 40 DEG C under the condition of preserving, compared to before the mutation, has high performance on low temperature tolerance.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种透明质酸酶突变体及其应用，属于酶工程领域。
技术介绍
透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)主要专一性水解透明质酸，广泛存在于真核和原核生物中，在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生，是一种重要的生理活性物质。且于1928年被DuranReynals首次发现并称为“扩散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶。根据透明质酸酶作用的底物特异性和催化机制，水蛭透明质酸酶属于透明质酸3-糖基水解酶家族(EC3.2.1.36)，通过水解HA的β-1、3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的透明质酸酶对底物的专一性强，与其它来源的透明质酸酶相比，它对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性，活性不受肝素影响。因此，水蛭透明质酸酶用于临床药用更具医疗价值意义。1941年Hirst首次证实水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性。相关研究实验已经证实透明质酸酶对治疗心肌梗塞效果显著。透明质酸酶在抗肿瘤方面也具有重要的作用，恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。此外，透明质酸酶在临床上作为“药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面具有更大的应用价值。目前，水蛭来源的透明质酸酶的最适pH为5～7，最适反应温度为36℃～38℃。该特性并不适合工业化应用。工业应用过程中，每将反应体系的温度从室温提高一度，都需要消耗更多的能量。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种透明质酸酶突变体，该突变体具有更宽泛的最适反应温度，催化活力也有提高。所述透明质酸酶突变的氨基酸序列，是在SEQIDNO.1所示氨基酸序列基础上，将第121位甘氨酸G突变为亮氨酸L，同时将299位的苏氨酸T突变为异亮氨酸I，同时将321位的丙氨酸突变为脯氨酸P。本专利技术还提供一种表达所述透明质酸酶突变体的重组菌，是以枯草芽孢杆菌168为宿主，以pMA5载体为表达载体，以wapA信号肽引导酶的分泌表达。在本专利技术的一种实施方式中，将信号肽wapA通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点重组至pMA5，再通过PCR获得编码N端有6个组氨酸的透明质酸酶突变体基因H，将基因H片段和携带信号肽wapA的pMA5载体均采用EcoRI、BamHI限制性酶切位点双切，然后连接，转化枯草芽孢杆菌168，得到重组菌。本专利技术还提供应用所述重组菌发酵生产透明质酸酶突变体的方法，是按10％的接种量将种子培养液转接种于发酵培养基中，发酵培养基的组成为酵母粉18g/L、蔗糖20g/L、磷酸二氢钠15g/L，硫酸钾4g/L，30℃220rpm培养，发酵培养60h。本专利技术将所述透明质酸酶突变体采用食品级安全的工业菌株枯草芽孢杆菌进行表达，获得了透明质酸酶生产菌株。以该重组枯草芽孢杆菌发酵，可在发酵上清液中收集得到透明质酸酶的突变体粗酶液，该酶在pH4～9的范围内保持很好的活性，相比突变前，在耐酸性能上有了提高；在温度25～40℃的条件下能保持很好的活性，相比突变前，在耐受低温的性能上有了显著提高。具体实施方式酶活测定方法：反应体系为1ml，用pH5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置2mg/ml的HA，反应体系加入400μl的HA溶液、100μl的发酵上清液酶液，缓冲液补足至1ml；在38℃反应20min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量，1U为一小时内水解产生1μg还原糖所需酶量。实施例1透明质酸酶突变体的获得(1)将SEQIDNO.2所示出发核苷酸序列中编码第121位甘氨酸G、299位的苏氨酸T、321位的丙氨酸A的序列通过分布PCR分别突变为编码亮氨酸L、异亮氨酸I、脯氨酸P的核苷酸序列。(2)向透明质酸酶突变体N端引入6个组氨酸，设计引物PCR获得编码N端有6个组氨酸的透明质酸酶突变体基因H。引物序列为：F：CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACR：CGCGGATCCTTATTTTTTGCAGGCTTCAACGTTAG以枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pMA5为表达载体，将信号肽wapA(MKKRKRRNFKRFIAAFLVLALMISLVPA)通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点重组至pMA5。将基因H片段和携带信号肽wapA的pMA5载体分别采用EcoRI、BamHI限制性酶切位点双切，载体和目的片段分别采用琼脂糖凝胶电泳切胶回收，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μlSolution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确。挑选测序正确的重组克隆菌pMA5-wapA-H。重组质粒电转入表达宿主Bacillussubtilis168中，重组克隆子经PCR验证正确。以相同策略表达突变前的透明质酸酶，作为对照1，以空载为阴性对照。(3)验证正确的重组枯草芽孢杆菌菌株pMA5-wapA-H进行发酵培养表达。单克隆接种于5ml的LB培养基，37℃、200rpm培养16h。按10％的接种量转接于25ml的表达无机盐培养基(酵母粉18g/L、蔗糖20g/L、磷酸二氢钠15g/L，硫酸钾4g/L)，30℃220rpm培养，发酵培养60h，离心收集发酵上清液，作为粗酶液，SDS-PAGE电泳分析发酵上清液的结果表明在58kDa左右出现目标条带，发酵液上清中酶活为1945.5U/ml，未突变的透明质酸酶的活力为15894U/ml，阴性对照未检出透明质酸酶活力。实施例2透明质酸酶突变体的活性测定(1)pH对酶活的影响在加酶之前，以0.1mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调整酶活测定体系的pH为别为2、3、4、5、6、7、8、9，分别测定透明质酸酶突变体、未突变的透明质酸酶的活力。以两酶各自在pH5.5的酶活反应体系为基础，计算各自的残余酶活。表1(2)温度对酶活的影响将透明质酸酶突变体、未突变的透明质酸酶的粗酶液分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下，保温30min，然后用于测定酶活。以两酶各自在38℃的酶活为基础，计算各自的残余酶活。表2虽然本专利技术已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本专利技术，任何熟悉此技术的人，在不脱离本专利技术的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本专利技术的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。SEQUENCELISTING<110>吴银娣<120>一种透明质酸酶突变体及其应用<160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>489<212>PRT<213>水蛭<400>1MetLysGluIleAlaValThrIleAspAspLysAsnValIleAlaSer151015ValSerGluSerPheHisGlyValAlaPheAsp本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种透明质酸酶突变体，其特征在于，所述透明质酸酶突变的氨基酸序列，是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列基础上，将第121位甘氨酸G突变为亮氨酸L，同时将299位的苏氨酸T突变为异亮氨酸I，同时将321位的丙氨酸突变为脯氨酸P。
【技术特征摘要】
1.一种透明质酸酶突变体，其特征在于，所述透明质酸酶突变的氨基酸序列，是在SEQIDNO.1所示氨基酸序列基础上，将第121位甘氨酸G突变为亮氨酸L，同时将299位的苏氨酸T突变为异亮氨酸I，同时将321位的丙氨酸突变为脯氨酸P。2.编码权利要求1所述透明质酸酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。4.一种表达权利要求1所述透明质酸酶突变体的重组菌，其特征在于，是以枯草芽孢杆菌168为宿主，以pMA5载体为表达载体，以wapA信号肽引导酶的分泌表达。5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，将信号肽wapA通过NdeI和EcoRI限制性酶切位点重组至pMA5，再通过PCR获得编码N端有6个组氨酸的...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴银娣，
申请(专利权)人：吴银娣，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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