细菌透明质酸酶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及源自S.koganeiensis的透明质酸酶、其应用及其制备方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及来源于S.koganeiensis的透明质酸酶、其应用和制造方法。
技术介绍
目前，临床领域中使用的透明质酸酶是动物来源的。尽管这种产品适合于被纯化，但其含有一些能够诱导免疫原性或过敏反应的污染物。透明质酸是细胞外基质的重要组分并且以显著的数量构成组织间屏障。透明质酸酶是切割透明质酸成为D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖的水解酶，其使得间质基质的可渗透性增加。以可变的方式，其也能够消化结缔组织的其他酸性黏多糖。能够在例如蚂蟥的口器中，在蛇、蜜蜂、蝎子的毒液中，以及在致病菌例如肺炎双球菌(pneumococci)、溶血性链球菌(haemolyticstreptococci)和金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的孵育物上清中发现高浓度的透明质酸酶。在人体中，在角膜中、睫状体中、脾中、皮肤中和睾丸中发现了透明质酸酶。也在精子中发现了大量的透明质酸酶，使得该酶能逾越保护胚珠的透明质酸的屏障。透明质酸酶在医学领域中被用于治疗水肿、局部炎症、痔疮和冻疮。此外，其在制药领域被用于促进通过皮下注射局部给药的某些高分子量活性成分(抗体、药物载体纳米颗粒、用于基因治疗的DNA、重组蛋白)的运输并增加其分布和分散，以可相比于静脉给药的量增加其生物利用度。[1]之前的研究已经示出了当与透明质酸酶同时给药或序贯给药时，直径达200nm的纳米颗粒在其运输通过胞间隙中会经历强劲增加[1]。目前为止认为该研究示出了纳米颗粒如何能够离体表达其功能，由此显示出在治疗和诊断领域的巨大潜力。然而，由于在临床实践中所使用的给药类型(皮下或胃肠道给药或由于静脉给药的毒性)、其分布体积和其毒性，人们也应该考虑纳米颗粒在体内跨越屏障的能力。因此，使用纳米颗粒和透明质酸酶制剂能够代表治疗和诊断未来的优异的和创新的起始点，其具有通过局部皮下给药用于治疗例如肿瘤学、眼科学和骨关节炎以使药物载体纳米颗粒可最终被用于常见临床实践的前景。一些类型的癌症，包括胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌已经显示出累积高水平的透明质酸(HA)。HA以异常方式的这种累积围绕某些类型的癌症产生保护网络并对其构成支持。HA与基质的其他组分的这种病理性累积还会使肿瘤的间质液的压力增加、肿瘤血管压缩，并且产生相比于正常细胞有利于癌细胞生长的独特微环境。这些机制对于药物的给予构成障碍，抑制了许多抗癌药的潜在效力。通过拆解确定肿瘤结构的HA组分，透明质酸酶通过开放之前受限制的血管以增加向肿瘤的血流来破坏肿瘤微环境。这使得抗癌治疗剂能够更有效地被运输至肿瘤靶标，增加其治疗效力。透明质酸酶还被用于化妆品中，以治疗由填充剂造成的肉芽肿性反应或透明质酸的不正确(即，不希望的)搭配，以及显著改善脂肪团中存在的纤维化病症。透明质酸酶通过使脂肪团的纤维化组分片段化使其变软且减少橘皮效应，从而使接受治疗的皮肤部分获得更加天然的和悦目的外观。迄今为止，透明质酸酶是唯一能够以治疗的或非治疗的目的击破脂肪团并且具有令人满意的结果的真正治疗方案。之前的研究已经显示出透明质酸酶在治疗心血管疾病例如动脉粥样硬化方面的效力[2]，但透明质酸酶能够对于血压控制的潜力尚不清楚[3]。临床研究已经证明了这些应用得到科学支持的心电图测试，其使得研究人血清在透明质酸酶(Wydase)活性方面的效力，牛睾丸透明质酸酶已经被广泛用于许多临床研究。以下结论是从这些临床研究总结获得的：-只有使用高度纯化的透明质酸酶才具有对于减少心肌梗死程度的较高临床价值[4]。-许多研究小组已经证实了人血液含有牛透明质酸酶的不耐热抑制剂[5,6]。尽管临床研究已经证实了透明质酸酶的效力，但这些结论还没有使得能够基于那些已经可从市场上获得的透明质酸酶能够确保用于控制心脑血管疾病静脉给药来开发透明质酸酶和/或新的治疗剂，由于较高的杂质水平，这限制了一些心血管治疗的应用。在兽医学领域，透明质酸酶被用于保护抗生素物质的溶液中，用于治疗动物疾病，例如牛乳腺炎。由于低生产率和酶在水溶液中变得不稳定且在纯化后丧失活性，迄今为止，以工业规模生产细菌或动物透明质酸酶还是困难的。另外，许多工业上生产的来自于动物提取物(来自牛和绵羊睾丸)的透明质酸酶具有传播动物海绵状脑病(所谓的\疯牛病\)的高风险。其他工业生产已经从哺乳动物细胞以可溶性重组形式生产了透明质酸酶(人PH20)，改善了纯度并且减少病毒感染[7]。本专利技术的目的是提供具有高纯度的用于制药和/或化妆品应用的细菌重组透明质酸酶。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供在水溶液中稳定的酶，其即使是长期以及在蛋白水解酶存在下也是稳定的，且完全避免了传播动物海绵状脑病的风险且在血流中具有高透明质酸酶活性而没有或病毒或细菌污染的可能性，从而其也可以静脉应用。本专利技术的另一个目的是提供用于以高产率制备有效的透明质酸酶的方法，并且其可在工业规模应用不存在困难。根据本专利技术，这些目的和下文中会变得跟明显的其他目的，是通过如下制备透明质酸酶的方法实现的，该透明质酸酶分离自StreptomyceskoganeiensisATCC31394，且包含SEQ.ID.No.21中示出的氨基酸序列，所述方法包括以下步骤：a)将细菌培养基与含有包含SEQIDNo.41所示的序列的至少一种载体的重组细胞的接种物一起接种到生物反应器中；b)在存在营养液的条件下，使步骤a)的所述生物反应器的内容物在pH为6.7至7.1之间经历发酵；c)向步骤b)的混合物中加入lac基因的诱导物；d)使步骤c)的混合物经历8至24小时的诱导期；e)将在步骤d)中获得的细菌细胞离心；f)重悬浮在步骤e)中获得的沉淀物并使所得的悬液经历渗压震扰；g)通过离心步骤f)的悬液来提取周质蛋白；h)通过如下顺序来纯化在步骤g)中获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分：i.强离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分；ii.弱阳离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分；以及iii.芳香疏水相互作用色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分。本专利技术的这些目的也可以通过可通过所述方法获得的包含SEQ.ID.No.21的源自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的透明质酸酶来实现。本专利技术的这些目的也已经通过来自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的纯化形式的且包含SEQ.ID.No.21中示出的氨基酸序列的透明质酸酶实现。本专利技术的这些目的也已本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备源自Streptomyces koganeiensis ATCC 31394的包含SEQ.ID.No.21所示的氨基酸序列的透明质酸酶的方法，包括以下步骤：a)将细菌培养基与含有包含SEQ ID No.41所示的序列的至少一种载体的重组细胞的接种物一起接种到生物反应器中；b)在存在营养液的条件下，使步骤a)的所述生物反应器的内容物在pH为6.7至7.1之间经历发酵；c)向步骤b)的混合物中加入lac基因的诱导物；d)使步骤c)的混合物经历8至24小时的诱导期；e)将在步骤d)中获得的细菌细胞离心；f)重悬浮在步骤e)中获得的沉淀物并使所得的悬液经历渗压震扰；g)通过离心步骤f)的悬液来提取周质蛋白；h)通过如下顺序来纯化在步骤g)中获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分：i.强离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分；ii.弱阳离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分；以及iii.芳香疏水相互作用色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.17 IT MI2013A0009921.制备源自StreptomyceskoganeiensisATCC31394的包含SEQ.ID.No.21所示的
氨基酸序列的透明质酸酶的方法，包括以下步骤：
a)将细菌培养基与含有包含SEQIDNo.41所示的序列的至少一种载体的重组细
胞的接种物一起接种到生物反应器中；
b)在存在营养液的条件下，使步骤a)的所述生物反应器的内容物在pH为6.7
至7.1之间经历发酵；
c)向步骤b)的混合物中加入lac基因的诱导物；
d)使步骤c)的混合物经历8至24小时的诱导期；
e)将在步骤d)中获得的细菌细胞离心；
f)重悬浮在步骤e)中获得的沉淀物并使所得的悬液经历渗压震扰；
g)通过离心步骤f)的悬液来提取周质蛋白；
h)通过如下顺序来纯化在步骤g)中获得的具有透明质酸酶酶促活性的蛋白流分：
i.强离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分；
ii.弱阳离子交换色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分；以及
iii.芳香疏水相互作用色谱并分离所述透明质酸酶酶促活性流分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤a)的重组细胞选自大肠杆菌的
细胞和枯草芽胞杆菌的细胞。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤b)中，使用甘油溶液
作为营养液。
4.源自Streptomyces...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢西亚诺·墨西拿，卢卡·穆苏梅奇，苏珊娜·瓦卡罗，
申请(专利权)人：菲迪亚医药公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT